Logo GenDocs.ru


Поиск по сайту:  


Реферат - Ознакомление с лабораторными исследованиями мяса на пищевые токсикоинфекции и токсикозы - файл 1.doc


Реферат - Ознакомление с лабораторными исследованиями мяса на пищевые токсикоинфекции и токсикозы
скачать (1020.5 kb.)

Доступные файлы (1):

1.doc1021kb.22.11.2011 23:10скачать

содержание

1.doc

Реклама MarketGid:
Департамент образования и науки Кемеровской области

ГОУ СПО «Мариинский аграрный техникум».




по дисциплине: ветеринарно-санитарная экспертиза

на тему: Ознакомление с лабораторными исследованиями мяса на пищевые токсикоинфекции и токсикозы.

Выполнила: студентка 411гр.

Преподаватель: Гаденова Е.А.


2009г
Оглавления.

Введение……………………………………………………………… 3

  1. Посев из представленного материала на питательные среды. ……..4

  2. Рост культуры сальмонелл на скошенном мясо – пептоном агаре. 7

  3. Характер бактерии на питательные средах. …………………………9

  4. Подсчет колоний на агаре………………………………………. 12

  5. Приготовление мазков из колоний, их окраска по Грамму…… 18

  6. Исследование бактерий на подвижность. …………………………21

  7. Дополнительные исследования для обнаружения сальмонелл, анаэробов. …………………………………………………………….25

Заключение …………………………………………………………..30

Литература …………………………………………………………..31


ВВЕДЕНИЕ
Пищевые токсикоинфекции (ПТИ) – обширная группа острых кишечных инфекций, развивающихся после употребления в пищу продуктов, инфицированных патогенными или условно-патогенными микроорганизмами. Клинически эти болезни характеризуются внезапным началом, сочетанием синдромов интоксикации, гастроэнтерита и частым развитием обезвоживания. Диагноз ПТИ является собирательным и объединяет ряд этиологически разных, но патогенетически и клинически сходных болезней.

Пищевые токсикоинфекции могут вызываться сальмонеллами, шигеллами, условно-патогенными микроорганизмами (Proteus vulga-res mirabilis, энтерококки), энтеротоксическими штаммами стафилококка (Staphylococcus sereus et albus), стрептококка (В-гемолитичес-кие стрептококки группы А), споровыми анаэробами (Clostridium рег-fringens), споровыми аэробами (Вас. cereus), галофильными вибрионами (Vibrio parahaemolyticus) и др.

Следует отметить, что до настоящего времени среди инфекционистов нет единого мнения о том, какие болезни следует относить к группе ПТИ. Так, Т. И. Дмитровская (1971), Е. П. Шувалова (1982) и др. к этой группе относят болезни, протекающие с синдромом гастроэнтерита и интоксикации, вызванные условно-патогенными возбудителями. Большинство других исследователей [Бунин К. В., 1962, 1972, 1978; Поставит В. А., 1979; Покровский В. И. с соавт., 1979, 1980, 1981; Михайлова Ю. М. 1980, 1981, и др.] к ПТИ относят все болезни, характеризующиеся синдромом гастроэнтерита, вызываемые как условно-патогенными, так и патогенными возбудителями, в том числе и сальмонеллами и шигеллами (до этиологической расшифровки диагноза), Правильность последней точки зрения подтверждается не только сходством патогенетических механизмов развития болезни и клинических проявлений, но и тем, что она сразу ориентирует практического врача на целенаправленную патогенетическую терапию при данной группе заболеваний. Практически во всех случаях при наличии характерных клинических признаков инфекционного гастроэнтерита и отсутствии данных лабораторного или эпидемиологического подтверждения ставится диагноз пищевой токсикоинфекции.


^ 1.Посев из представленного материала на питательные среды
I. Метод полуавтоматического ШТРИХОВОГО ПОСЕВА

применяется при исследовании пищевых (в т.ч. молочных) продуктов с предполагаемым высоким содержанием микроорганизмов.

1.Установить НоваСтрик вертикально на ровной поверхности. Одной рукой удерживая пробирку, отвинтить другой рукой крышку и быстрым движением вытащить лопасть, манипуляцию посева можно производить, удерживая НоваСтрик в руке.

2.Удерживая лопасть строго вертикально, погрузить зубцы на несколько секунд, приблизительно до половины их длины, в контейнер с пробой, без предварительного её разведения для жидких продуктов; для сухих продуктов пробу предварительно развести стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:10 или 1:1.

Ограничения: НЕ ПРИКАСАТЬСЯ РУКАМИ К ВНУТРЕННИМ СТЕРИЛЬНЫМ ЭЛЕМЕНТАМ ЛОПАСТИ И ПЛАСТИКОВОГО КОЛЬЦА!

3.Вставить зубцы лопасти в отверстие исходной пробирки НоваСтрика, а затем быстрым, вертикальным и продолжительным усилием (шлепком ладони или ударом пальца) втолкнуть лопатку в пробирку и закрутить крышку.

4.Инкубировать НоваСтрик при температуре (37+1)°С в течение 18-20 часов, предварительно открутив крышку на полоборота.

5.Определить наличие и характер колоний. Определить концентрацию микроорганизмов в милилитре пробы, сравнивая плотность проросших колоний на каждой стороне агара с приложенным к упаковке НоваСтрика BD-521 графиком плотности роста колоний методом полуавтоматического ШТРИХОВОГО ПОСЕВА. При необходимости следует умножить результат на фактор разведения пробы.
Пример 1 : Посев произведен без разведения пробы, выросло на одной агаровой поверхности 20 колоний - концентрацию микроорганизмов в 1 мл определяем с помощью графика плотности роста колоний методом полуавтоматического ШТРИХОВОГО ПОСЕВА - на оси абсцисс находим количество колоний (20), проводим линию до пересечения с графиком, опускаем перпендикуляр на ось ординат, получаем результат - 6x103 КОЕ в мл.
Пример 2 : Посев произведен из разведения 1:10, выросло на агаровой поверхности 20 колоний, с помощью Графика плотности роста колоний методом полуавтоматического ШТРИХОВОГО ПОСЕВА находим концентрацию КОЕ, результат умножаем на 10 -6,0х103х 10 = 6х104).

II. Метод ПОГРУЖЕНИЯ СЛАЙДА в пробу

применяется при исследовании пищевых (в т.ч. молочных) продуктов с предполагаемым низким содержанием микроорганизмов или при посеве из накопительной среды.

1.Отвинтить крышку НоваСтрика и быстрым движением извлечь лопатку.

2.Немедленно вставить зубцы лопатки в отверстие исходной пробирки НоваСтрика, а затем быстрым, вертикальным и продолжительным усилием (шлепком ладони или ударом пальца) втолкнуть лопатку в пробирку (для того, чтобы установить зубцы в верхнюю позицию).

3.Извлечь лопатку вновь и, удерживая строго вертикально, погрузить ее на несколько секунд в пробу или контейнер с засеянной накопительной средой до полного покрытия агара. Разрешается облить пробой поочередно две стороны лопасти , до полного покрытия агаров.

4.Извлечь лопатку из контейнера, стряхнуть избыток пробы в контейнер, вставить лопатку в пробирку и закрутить крышку.

5.Перед помещением в инкубатор открутить крышку на полоборота, инкубировать засеянный НоваСтрик при температуре (37±1) °С в течение 18-20 часов.

6.Определить наличие и характер колоний. Определить концентрацию микроорганизмов в милилитре пробы, сравнивая плотность проросших колоний на каждой стороне агара с приложенным к упаковке НоваСтрика Графиком плотности роста колоний методом погружения слайда в пробу, при необходимости умножив результат на фактор разведения пробы.

Пример 1: произведен посев без разведения пробы, выросло 20 колоний, концентрацию микроорганизмов в 1 мл определяем с помощью Графика плотности роста колоний методом погружения слайда в пробу - на оси абсцисс находим количество колоний (20), проводим линию до пересечения с графиком, опускаем перпендикуляр на ось ординат, получаем результат - 2,Ох.1О3 КОЕ в 1 мл).

III. КОНТАКТНЫЙ метод
применяется при исследовании следующих материалов:
Смывы с рабочих поверхностей, кожных покровов рук, спецодежда
оборудование и др.

1.Отвинтить крышку НоваСтрика и быстрым движением вытащить лопатку.

2.Немедленно вставить зубцы лопатки в отверстие исходной пробирки НоваСтрика, а затем быстрым, вертикальным и продолжительным усилием (шлепком ладони или ударом пальца) втолкнуть лопатку в пробирку (для того, чтобы установить зубцы в верхнюю

позицию).

3.Извлечь лопатку вновь и удерживая рукой за крышку, легким усилием прижать лопатку одной стороной агара к исследуемой поверхности в течение нескольких секунд. Перевернуть лопатку и повторить манипуляцию со второй стороной НоваСтрика.

Ограничения: НЕ ПРИКАСАТЬСЯ РУКАМИ К ВНУТРЕННИМ СТЕРИЛЬНЫМ ЭЛЕМЕНТАМ ЛОПАТКИ!

4.Вставить лопатку в пробирку и ввернуть крышку.

5.Отправить засеянный НоваСтрик с прикрепленным к нему направлением на анализ , в лабораторию для последующей инкубации и дальнейшего исследования. В случае затруднений в немедленной отправке засеянного НоваСтрика в лабораторию, разрешается хранить его в плотно закрытом состоянии, при комнатной температуре до 48 часов.

Ограничения: НЕ ПОМЕЩАТЬ ЗАСЕЯННЫЙ НОВАСТРИК В ХОЛОДИЛЬНИК!

6.При поступлении в лабораторию, инкубировать НоваСтрик в вертикальном положении (предварительно открутив крышку на полоборота) при температуре (37±1)°С в течение 18-20 часов.

7.Определить концентрацию микроорганизмов в миллилитре пробы сравнивая плотность проросших колоний на каждой стороне агара с приложенным к упаковке НоваСтрика Графиком плотности роста колоний при посеве КОНТАКТНЫМ методом.

9. Определение общего микробного числа и бактерий группы кишечной палочки (НоваСтрик BD - 507)

9.1 Рабочие среды:

a) РСА - питательная среда общего назначения, используемая для обнаружения и количественного учета обсеменения бактериями, дрожжевыми и плесневыми грибами.

b) VRBA - селективная питательная среда для обнаружения колиформных микроорганизмов в продуктах питания. Селективность среды обусловлена присутствием таких ингибиторов, как желчные соли и кристаллический фиолетовый. Дифференциация кишечной группы микроорганизмов достигается благодаря комбинации лактозы и индикатора нейтрального красного. Бесцветные или розово-красные колонии образуются в зависимости от способности микроорганизма ферментировать лактозу.

9.2 Чувствительность НоваСтрик позволяет определять загрязнение при концентрациях 10 мк/мл при посеве методом погружения слайда в пробу и 10 мк/мл при посеве штриховым методом. Время проведения анализа бактериального загрязнения проб (от посева до получения результата) не более 18-20 часов.

9.3 Общее микробное число

Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г/мл продукта определяется штриховым методом посева на НоваСтрик (путем погружения засевающих зубцов в пробу без предварительного ее разведения (жидкие и полужидкие продукты), продукты твердой консистенции засевать после предварительного размельчения и разведения стерильной водой в соотношении 1:1 или 1:10).

9.4 Бактерии группы кишечной палочки.
№ Масса продукта, в которой не допускается Методика посева на НоваСтрик Положительный результат
1 0,001 Посев производится методом штрихового посева. Полное отсутствие колоний nacpeneVRBA
2 0,01 Посев производится методом погружения слайда в пробу. Полное отсутствие колоний HacpefleVRBA
3 0,1 Посев производится пипеткой, нанести на поверхность агара 0,1 мл образца. Полное отсутствие колоний на cpefleVRBA


БГКП - не допускаются в 1,0 мл/г и более - требуемое количество исследуемого продукта поместить в накопительную среду (Кесс-лера) и, после инкубации 18-24 часа, произвести посев на НоваСтрик методом погружения агаровой пластинки в пробу (либо смочить поверхность агаровой пластинки другим способом - облить, нанести пипеткой).


  1. ^ Рост культуры сальмонелл на скошенном мясо – пептоном агаре.


Схема идентификации выделенных бактерий с бактериями рода сальмонелл

Идентификация культур, выделенных из испражнений, крови и других материалов, подвергшихся ис-следованию, является самым ответственным и самым трудным этапом бактериологической диагностики кишечных заболеваний. Идентификация микробных культур, выделенных у больных и бактерионосителей, начинается с отграничения колоний сальмонелл от сходных с ними колоний патогенных и непатогенных представителей семейства кишечных бактерий.

Второй день исследования. 1. Просматривают посевы, сделанные на дифференциально-диагностических средах, простым глазом и через лупу (Х5 или Х10), чтобы не пропустить мелкие колонии. Если через 24 ч после произведенного посева на висмут-сульфитной среде роста колоний, характерных для сальмонелл, не видно, чашки оставляют в термостате еще на сутки.

2. Из колоний, подозрительных на сальмонеллы, делают мазок, окрашивают его по Граму и микроскопируют.

3. Три—пять колоний с признаками, характерными для ти-фо-паратифозных бактерий, отсевают на среду Ресселя или на скошенный столбик агара с мочевиной для накопления чистой культуры и определения ферментативных свойств в отношении глюкозы и лактозы. На комбинированной среде посев делают сначала на скошенную поверхность, а затем уколом в глубину столбика.

4. В этот же день производят высевы со сред обогащения по аналогии первичного посева на две чашки со средой Плоскирева и висмут-сульфитной средой. Дальнейшее исследование этих посевов ведут по общепринятой схеме с задержкой на 1 день.

Третий день. 1, Для определения чистоты выделенных культур со среды Ресселя или скошенного столбика агара с мочевиной делают мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют.

2. Учитывают ферментативные свойства микробов, выросших на среде Ресселя и агаре с мочевиной. Тифопаратифоз-ные. бактерии, не расщепляющие лактозы, не изменяют окраски скошенной поверхности, но окрашивают в соответствии с изменением цвета индикатора столбик среды вследствие фермеытации глюкозы с образованием кислоты (при наличии индикатора Андреде столбик среды окрашивается в розовый цвет). Паратифозные бактерии, расщепляющие глюкозу с кислото- и газообразованием, не только изменяют окраску столбика среды, но и вызывают в нем появление пузырьков газа.

Культуры, сбраживающие на среде Ресселя лактозу и глюкозу с образованием кислоты и газа (разновидности кишечной палочки) или расщепляющие в скошенном столбике мочевину (протей), больше не исследуют. Дается ответ «Патогенных бактерий семейства кишечных в исследуемом материале не обнаружено».

3. Культуры, индифферентные в отношении лактозы, но сбраживающие глюкозу с образованием кислоты или кислоты и газа (изменение цвета в столбике среды, вспенивание конденсационной жидкости, иногда разрыв агара), как подозрительные на сальмонеллы засевают для определения подвижности уколом в полужидкий (0,2—0,5%) мясо-пептонный агар или в 1 мл подогретого до температуры 37° С мясо-пептонного бульона.

В тот же день из 4—5-часовой бульонной культуры готовят для микроскопирования препарат «раздавленной» или «висячей» капли. Бактерии рода сальмонелл обладают активной подвижностью.

4. Для более полной биохимической характеристики культуры выделенного микроба пересевают на среды Гисса с ман-нитом, мальтозой, сахарозой, сорбитом, адонитом, салицином, дульцитом, в бульон Хоттингера для определения сероводорода, в среду Строгова или другие среды для определения индола, в столбик питательного желатина и в пробирку с лакмусовым молоком.

5. В тот же день приступают к изучению антигенной структуры выделенных бактерий с применением адсорбированных сальмонеллезных поливалентных и монорецепторных сывороток. Принцип серологической идентификации бактерий группы сальмонелл заключается в том, что в первую очередь определяется групповая принадлежность по О-соматиче-ским сывороткам, затем в пределах установленной группы определяют типовую принадлежность бактерий с помощью Н-сывороток к специфическим фазам Н-антигена.


  1. ^ Характер бактерии на питательные средах.


Питательные среды — субстраты, состоящие из компонентов, обеспечивающих необходимые условия для культивирования микроорганизмов или накопления продуктов их жизнедеятельности.
Питательные среды различаются по назначению, консистенции и составу. По назначению их условно подразделяют на две основные группы — диагностические и производственные среды. Диагностические П. с. включают пять подгрупп: среды для выращивания широкого спектра микроорганизмов; среды для выделения конкретного возбудителя; дифференциальные среды, позволяющие различать отдельные виды микроорганизмов; среды для идентификации микроорганизмов и накопительные среды, предназначенные для обогащения конкретного вида микроорганизмов. К числу производственных относятся П. с., используемые при промышленном изготовлении медицинских биологических препаратов (бактериальных вакцин, анатоксинов и др.) и контроле их качества. П. с. для производства бактерийных препаратов в отличие от диагностических сред не должны содержать вредных для человека примесей и оказывать отрицательного влияния на процесс производства (не препятствуя, в частности, удалению из изготавливаемых препаратов продуктов микробного метаболизма, балластных органических и минеральных веществ).
По консистенции различают жидкие, плотные и полужидкие среды. Плотные и полужидкие П. с. готовят из жидких посредством прибавления к ним агара или (реже) желатина. Агар-агар — полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. Агар обычно вносят в П. с. в концентрации 1—2% (при изготовлении полужидких сред — 0,2—0,4%), желатин — 10—15%. При t° 25—30° желатиновые среды плавятся, поэтому микроорганизмы на них выращивают преимущественно при комнатной температуре. В качестве плотных сред применяют также свернутую сыворотку крови, свернутые яйца, картофель и среды, содержащие 1,5% силикагеля.
По составу П. с. делят на простые и сложные. Простые П. с. обеспечивают питательные потребности большинства патогенных микроорганизмов (мясопептонный бульон, мясопептонный агар, бульон и агар Хоттингера, питательный желатин, пептонная вода и др.). К сложным относят специальные среды для микробов, которые не растут на простых П. с. Такие среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма. Сложными П. с. являются и дифференциально-диагностические среды, например среды Гисса с углеводами и индикатором, применяемые для определения видовой принадлежности исследуемого микроба по его ферментативной активности. Некоторые сложные среды, так называемые селективные, или элективные, используют для целенаправленного выделения одного или нескольких видов микроорганизмов путем создания оптимальных условий их выращивания и угнетения роста сопутствующей микрофлоры. Например, висмут-сульфитный агар — строго селективная среда для выделения сальмонелл, агар и среда Левина — слабоселективные среды для выделения энтеробактерий.
В зависимости от состава исходных компонентов различают также среды синтетические, полусинтетические и природного происхождения. Синтетические среды, составные части которых точно известны, и несколько в меньшей степени полусинтетические удобны и используются главным образом для изучения физиологических процессов микроорганизмов. Применение сред такого типа позволяет определить минимальные потребности отдельных микроорганизмов в питательных веществах и, исходя из этого, создать П. с., содержащие лишь те соединения, которые необходимы для роста данного микроба. Преимуществом синтетических П. с. является также их стандартность, однако использование этих сред ограничено из-за высокой стоимости и сложности состава многих из них (нередко они содержат до 40 и более ингредиентов). К тому же они более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми компонентами П. с., особенно аминокислотами, и размножение микроорганизмов на таких средах легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами.
В микробиологической практике продолжают широко использовать среды природного происхождения, химический состав которых известен недостаточно. Основу таких сред изготавливают из различного сырья животного или растительного происхождения: мяса и его заменителей, рыбы, крови животных, казеина, дрожжей, картофеля, сои и др. Вид и качество этого сырья по существу во многом предопределяют питательную ценность и стандартность применяемых основ и в значительной мере самих сред.
Наряду с белковыми основами П. с. должны содержать зольные элементы (фосфор, серу, кальций, магний, железо) и микроэлементы (бор, молибден, кобальт, марганец, цинк, никель, медь, хлор, натрий, кремний и др.). Эти вещества необходимы для многих биосинтетических процессов у бактерий, однако потребность в них у разных видов микроорганизмов неодинакова. Так, например, марганец и железо требуются для кишечной палочки и возбудителей чумы, а калий — для молочнокислых бактерий. Марганец, кальций, магний, калий и железо стимулируют рост сибиреязвенной палочки, а магний, железо и марганец — рост бруцелл.
Для культивирования многих патогенных микроорганизмов необходимо наличие в среде так называемых факторов роста, представленных прежде всего водорастворимыми витаминами. Хотя бактерии не используют эти вещества как пластический или энергетический материал, тем не менее они являются обязательными компонентами питательных сред, т.к. их отсутствие тормозит образование многих ферментов. Факторами роста могут быть также некоторые органические кислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и аминокислоты. Отдельные аминокислоты (L-цистин, D—пироглутаминовая кислота и др.) способны стимулировать рост одних микроорганизмов и, наоборот, угнетать рост других.
Питательные среды должны содержать все необходимые для выращиваемых микроорганизмов химические элементы в легко усвояемой форме и оптимальных количествах. Источником углерода в П. с. обычно служат отдельные углеводы, соли органических кислот, а также углерод, входящий в состав азотсодержащих соединений (белков, пептонов, аминокислот и др.). Потребности в азоте удовлетворяются при наличии в средах нативного животного белка (кровь, сыворотка, асцитическая жидкость и т.п.), пептонов, аминокислот, солей аммония и других азотсодержащих веществ (пуриновые и пиримидиновые основания, мочевина и др.). В питательные среды вносят минеральные соли, необходимые для микроорганизмов. Микроэлементы, требующиеся бактериям в ничтожно малых количествах, обычно попадают в П. с. либо с водой, которая используется для приготовления среды, либо с сырьем, входящим в состав П. с. Факторы роста поступают в среду с различными диализатами, экстрактами и аутолизатами в виде аминокислот, пептидов, пуриновых и пиримидиновых оснований и витаминов.


  1. ^ Подсчет колоний на агаре.


По существу бактериология превратилась в экспериментальную науку начиная с того момента, когда Роберт Кох по совету Фанни Хессе впервые в лабораторной практике использовал чашки с агаровой средой. Это позволило не только осуществлять клонирование чистых культур, но также подсчитывать количество колоний, образующихся из отдельных «жизнеспособных клеток». Существует много вариантов этого метода. 1. Метод посева в агар: пробу вносят пипеткой в пустую стерильную чашку Петри, в которую затем вливают расплавленный, но остуженный до температуры 45°С агар; содержимое осторожно перемешивают и дают агару застыть. 2. Метод посева на поверхность агара: небольшие (0,1 мл) объемы разбавленной культуры вносят пипеткой непосредственно на поверхность затвердевшего агара в чашке Петри и затем клетки распределяют по поверхности с помощью стеклянного или тефлонового шпателя. 3. Метод посева в тонком слое: разбавленную культуру вносят в пробирки с небольшим объемом (2,5— 3,5 мл) расплавленного агара (0,6—0,75%), затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшего агара, и дают застыть верхнему слою. 4. Метод посева в многослойный агар напоминает предыдущий. Он отличается лишь тем, что на верхний слой засеянного застывшего агара наливают или наносят пипеткой дополнительный слой стерильного агара. Поэтому все колонии развиваются под поверхностным слоем агара. 5. Метод мембранных фильтров: разбавленную культуру фильтруют через соответствующий предварительно тщательно промытый мембранный фильтр, который затем переносят на питательный агар в чашке или на фильтровальную бумагу, пропитанную концентрированной питательной средой.

Вариантом метода посева в агар является посев на агар (или в агар) во вращающиеся пробирки и микротрубки; при этом мелкие колонии можно рассматривать в микроскоп. Имеются и другие варианты перечисленных выше методов. Использование автоматического подсчета колоний создает дополнительные специфические ограничения при работе этими методами, однако оно позволяет быстро и без ошибок, свойственных исследователю, просчитывать колонии в чашках Петри. Ниже описываются два метода. Один из них — это метод посева в чашки на поверхность агара, при котором все выросшие колонии являются поверхностными. Именно на поверхностных колониях изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. Подповерхностные колонии часто отличаются по цвету от поверхностных, так как они развиваются в других условиях аэрации и, следовательно, характеризуются другой способностью к кислотообразованию и другим окислительно-восстановительным потенциалом. Второй метод — посев в многослойный агар — обладает своими преимуществами: поскольку здесь все колонии развиваются под слоем агара, они невелики, компактны и могут интенсивно окрашиваться. В чашке в данном случае может вырастать значительно больше колоний по сравнению с другими методами, причем вероятность их слияния невелика. Можно просчитать несколько тысяч колоний на чашке и получить достоверные результаты. Поскольку при использовании других методов основная сложность заключается в подсчете нарастающего числа колоний на чашку, совершенно очевидно, что в этом плане данный метод явно следует предпочесть другим. Существует правило, согласно которому оптимальное для подсчета число колоний на чашку лежит в пределах от 30 до 300. Нижний предел устанавливается из соображений статистической достоверности, а верхний — из-за опасности слияния индивидуальных колоний. Указанный 10-кратный диапазон неудобен для многих экспериментов, поскольку в ряде случаев при разведении трудно заранее определить, будет ли число колоний входить в указанный сравнительно узкий диапазон. Дополнительные усилия по приготовлению чашек с многослойным агаром окупаются тем, что вырастающие в этом случае колонии можно считать в широком диапазоне (от 30 до 2000). Вторым важным преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом питательной среды. Первым слоем в чашки Петри можно разлить минимальную среду с агаром и в таком виде хранить их неопределенно долго. Может храниться также подготовленная для посева и разлитая по пробиркам1 минимальная полужидкая среда с агаром. В агар, используемый для верхнего слоя, можно добавлять необходимые питательные вещества в 10—50-кратном избытке. При необходимости к полужидкому агару добавляют красители или хромогенные субстраты, облегчающие обнаружение колоний.
Посев в чашки на поверхность агара
Подходящую агаровую среду разливают в стеклянные или пластмассовые чашки Петри (диаметром 9 см). Из ряда методик заполнения и подсушивания чашек можно рекомендовать следующую.

1. После автоклавирования и добавления термола-бйльных субстратов (сахаров, красителей, антибиотиков, хромогенных субстратов) закрытую емкость с расплавленным агаром помещают в лоток с горячей (45—50 °С) водопроводной водой. Агар быстро и равномерно охлаждается, достигает температурного плато выше точки застывания агара (обычно для 1 л агара достаточно инкубации в течение 30 мин). При этом образования геля возле стенок емкости не происходит. Такой достаточно охлажденный агар при разливе дает лишь немного конденсата на внутренней поверхности крышек чашек Петри.

2. Агар в чашки Петри заливают возле зажженной бунзеновской горелки. Если на поверхности агара появляются пузыри, пламя горелки немедленно направляют на эти участки, пока пузыри не лопаются. Обычно для чашки с диаметром 9 см достаточно 15—20 мл агара, что соответствует высоте слоя 0,24—0,32 см. Чем толще слой, тем менее контрастно выглядят колонии на агаровом фоне. В тонких слоях агара из-за ограничения некоторых питательных субстратов или локального подсыхания агара могут вырастать мелкие колонии и может уменьшаться их число, особенно в истонченных участках агарового слоя.

3. В зависимости от влажности чашки подсушивают при комнатной температуре 12—24 ч.

4. Чашки хранят при 4°С в закрытых пластмассовых контейнерах неограниченное время.

Посев производят следующим образом. 1. На основании имеющейся информации готовят разведения культуры таким образом, чтобы получить после инкубации 100—200 колоний на чашку. Для подсчетов, однако, можно использовать и чашки в более широком диапазоне числа колоний (30—300). Если колонии мелкие, удается просчитать до 500 колоний в одной чашке. При работе со стеклянными чашками и пипетками для разведения суспензий бактерий используют растворы, препятствующие адсорбции клеток на стекле, например растворы с высокой ионной силой, с низким рН (4—5) или содержащие немного нетоксичного анионного детергента. Можно также использовать пластмассовые чашки Петри и пластмассовые наконечники на пипетки.

2. Разведения проводят несколькими способами. Традиционно к 1 мл пробны добавляли большие (99 мл) объемы соответствующего стерильного раствора; однако с усовершенствованием техники все чаще стали использовать небольшие объемы, экономя реактивы и время, необходимое для перемешивания. Современные полуавтоматические пипетки с пластмассовыми наконечниками позволяют работать с очень малыми объемами, однако такие пипетки трудно стерилизовать. Для многих целей можно использовать 0,1-миллилитровую серологическую пипетку и добавлять 0,1 мл культуры к 0,9 или 4,9 мл раствора, которым разводят пробы (в пробирках 13Х Х100 мм), или к 9,9 мл этого раствора (в пробирках 16X150 мм). При оптимальном разведении облегчается перемешивание.

3. 0,1 мл разведенной культуры наносят на поверхность агара в чашке Пе(три. Для этого 2—3 капли капают на поверхность, а оставшуюся в пипетке жидкость выдувают (в автоматической пипетке нажимают поршень до упора). Это делают быстро, поскольку клетки имеют тенденцию немедленно прикрепляться к твердому субстрату.

4. Шпатели стерилизуют погружением в спирт, удаляют избыток последнего и обжигают в пламени горелки. Шпатель можно изготовить из большой скрепки для бумаг. Скрепку изгибают, как показано на рисунке, надевают на ее конец специальную тефлоновую трубку и слегка нагревают на огне, чтобы трубка плотно охватила проволоку. Часть скрепки, используемую в качестве ручки, можно изогнуть наиболее удобным образом. По сравнению с толстыми стеклянными палочками такой шпатель обладает низкой теплоемкостью, быстро остывает и значительно более инертен по отношению к бактериальным клеткам. Подобный шпатель можно так же быстро изготовить из пастеровской пипетки. 5. Культуру равномерно распределяют по агару в чашке, стараясь покрыть всю его поверхность вплоть до периферии. Равномерный посев требует определенного опыта. После инкубации проверяют распределение колоний на всех чашках, чтобы убедиться в равномерности посева. Лучшими для оценки равномерности посева являются чашки с наибольшим числом выросших колоний, хотя подсчет колоний в этом случае затруднителен. Если количество колоний, выросших вокруг наносимых на агар капель суспензии, выше, чем на остальной поверхности, то технику распределения следует улучшить. Капли влаги на крышках чашек Петри удаляют интенсивным встряхиванием крышек. Чашки с разлитым в них агаром следует подсушивать до тех пор, пока капля жидкости (0,1 мл), наносимая пипеткой, не поглотится агаром в течение 15—20 с.

6. Перевернутые чашки инкубируют при постоянной температуре в хорошо термостатируемой комнате или камере. Лучше использовать закрытые контейнеры, однако их не следует перегружать чашками. Если тем не менее без этого не обойтись, увеличивают время для выравнивания температуры чашек и камеры, что особенно важно при работе с температурочувстви-тельными мутантами. Инкубация в закрытых контейнерах позволяет также избежать токсического воздействия вредных газов, которые могут присутствовать в атмосфере термостатируемых помещений общего назначения (например, паров уксусной кислоты, используемой для обесцвечивания гелей). Непрозрачные контейнеры защищают светочувствительные компоненты сред и красители от инактивации светом. Наконец, в контейнерах среда в чашках не высыхает, и поэтому такие чашки пригодны для наблюдения за медленно развивающимися или поздно появляющимися колониями. Еще одной проблемой является поддержание необходимой концентрации С02, поскольку в СО? могут нуждаться даже организмы, выделяемые обычно в отсутствие высоких концентраций этого газа. Эта зависимость особенно наглядно выявляется в случае нанесения на агар отдельных редких клеток из разбавленных суспензий и при инкубации в обычной лабораторной атмосфере. Хотя эти проблемы возникают далеко не всегда, о них надо помнить.

7. Наблюдение за чашками начинают до того, как колонии разовьются в полной мере. Часто вырастает слишком много колоний. Тогда прибегают к дополнительным разведениям и посевам либо к подсчетам (с помощью лупы) мелких недоразвившихся колоний, опасность слияния которых меньше, нежели в случае крупных развитых колоний. 8. Подсчет колоний следует вести при хорошем освещении, однако соответствующее оборудование далеко не всегда придается к обычным счетчикам колоний.
Посев в многослойный агар
1. Готовят чашки Петри с первым слоем агаризован-ной среды (1,5% агара, толщина слоя около 0,4 см). Как первую, так и последующие среды наливают в чашки, установленные на строго горизонтальной поверхности (с помощью уровня).

Заполняют небольшие (13X100 мм) пробирки 2,5— 3 мл 0,7%-ного расплавленного агара. Удобно иметь приготовленные заранее бутыли с агаровой средой, содержащей основные компоненты. Агар в бутылях расплавляют (это можно сделать в микроволновой печи лри наличии определенного навыка, следя за тем, чтобы агар бурно не вскипал) и добавляют к нему необходимые питательные компоненты, красители и ингибиторы. Аликвоты готовой горячей среды переносят пипеткой в предварительно прогретые до 45°С серологические пробирки (13ХЮ0 мм). Работа с горячей средой снижает вероятность заражения посторонними бактериями. При 45 °С агар остается жидким в течение нескольких часов. При 50 °С это время еще больше, однако при этой температуре гибнут многие бактерии.

2. Пробы с культурой разводят, как описано выше.

3. Переносят чашки Петри в комнату с температурой 25—30 °С.

4. Делают отметку на наружной стороне серологической пробирки и наносят на внутреннюю поверхность пипеткой 0,1 мл разведенной пробы.

5. Расплавленный агар немедленно выливают из пробирки в чашку Петри таким образом, чтобы, вытекая, он смыл приставшие к стеклу клетки на месте внесения пробы. Это позволяет не только перенести все клетки в чашку, но и равномерно перемешать их с агаризованной средой; кроме того, при этом уменьшается адсорбция клеток на стекле.

6. Чашку наклоняют и покачивают, чтобы расплавленный агар, содержащий клетки, равномерно покрыл всю поверхность первого слоя.

7. Чашку помещают на установленный по уровню столик и дают агару застыть. . Эту процедуру проводят и с другими чашками, необходимыми в опыте.

9. Добавляют пипеткой или выливают из пробирки 2,5—3 мл 0,7%-ного расплавленного агара на застывшую поверхность и покачиванием равномерно распределяют его. Чашки помещают на установленный по уровню столик и дают застыть третьему слою агара.

10. Чашки можно инкубировать в любом положении, поскольку при использовании этого метода возможность заражения и высыхания значительно ниже, чем при методе посева в чашках на поверхность агара.

11. Следят за ростом колоний и просчитывают их. Колонии, растущие под поверхностью, более компактны, имеют четко очерченные края и меньший размер по сравнению с обычными поверхностными колониями. Их труднее считать, однако увеличительные стекла или специальные насадки на очки помогают снизить напряжение глаз в процессе счета.

Дополнительные затраты труда, необходимые при посеве в многослойный агар, оправдываются, когда вырастает очень много колоний. Равномерность распределения колоний по чашке определяют визуально. Если распределение действительно равномерно, просчитывают колонии в какой-либо части чашки и затем получают общее их число на чашках перемножением. Использование бинокулярной лупы позволяет избежать трудностей, связанных с подсчетом мелких и близко расположенных колоний, и в ряде случаев «спасти» эксперимент, узким местом которого оказался именно этап подсчета колоний.


  1. ^ Приготовление мазков из колоний, их окраска по Грамму.

Подготовка проб почвы с исследуемых участков
Пробы почвы нужно брать с помощью кернов диаметром около 10 мм на глубину 10- 20 см. Керны лучше предварительно простерилизовать в кипящей воде (100 0С).
Пробы следует помещать в стерильные чашки Петри, которые затем нужно загерметизировать. ½ весовую часть каждой пробы обычно берут на химический анализ (изучение концентрации азотосодержащих ионов), остальная часть идет на микробиологический анализ.
Химический анализ концентрации нитритов (NO2-), нитратов (NO3-) и аммония (NH4+) в почве с помощью аквариумного набора

Химический анализ концентрации нитритов (NO2-), нитратов (NO3-) и аммония (NH4+) в почве с помощью аквариумного набора
Из каждой пробы нужно взять навеску почвы (около 10 грамм каждая).
Далее в почву следует добавить около 50 мл дистиллированной воды и перемешивать до гомогенного состояния (объем дистиллированной воды измеряется мерным цилиндром с точностью до 1 мл). После этого раствор через сито с ячеей 0,5 мм лучше отфильтровать от крупных частиц грунта. Затем раствор нужно центрифугировать в течение 3-5 минут.
Полученный надосадок используется для дальнейшего анализа с помощью тест-наборов для аквариумной воды. С помощью этого набора можно определить концентрации нитритов (NO2-), нитратов (NO3-) и аммония (NH4+)в мольных долях (α). Расчет массовой доли азотсодержащих соединений в пробах проводится по формулам:
ω (NO3-)=α*M*,
ω (NO2-)=α*M*,
ω (NH4+)=α*,
где
ω — массовая доля нитритов (NO2-), нитратов (NO3-) и аммония (NH4+)в мольных долях (α).
m — масса навески почвы
M — масса дистиллированной воды, добавляемую в навеску
α — мольная доля нитритов (NO2-), нитратов (NO3-) и аммония (NH4+)
[править]

Изучение экзоферментной активности микроорганизмов на исследуемых участках
Микробиологическая активность почв может быть определена по протеазной активности почвенноживущих микроорганизмов, а протеазная активность почв определяется активностью экзоферментов почвенных микроорганизмов и зависит от их численности и активности. Экзоферменты- ферменты, выделяемые микроорганизмами во внешюю среду, которые расщепляют белки, полисахариды и липиды.
В чашки Петри с образцами почвы нужно поместить нарезанную по 2-3 кадра засвеченную фотопленку, предварительно замоченную в воде на 10 минут. Воду следует предварительно простерилизовать кипячением в течение 10 минут (100 0С). Также лучше поместиь один фрагмент пленки в пустую стерильную чашку Петри (контроль) для того, чтобы в конце эксперимента сравнить полученные результаты с контролем и минимизировать риск возникновения погрешностей.
Далее образцы почвы нужно выдерживать при комнатной температуре (20 0С) 9 дней. Затем пленку следует осторожно вынуть и промыть под струей воды, после чего высушить. После этого нужно подсчитать процент «съеденного» эмульсионного слоя по палетке. Чем выше процент разрушения эмульсионного слоя, тем выше экзоферментная активность почвы.
Окраска по методу Грама

Основная статья: Окраска по Граму
Особенностью окраски по методу Грама является неодинаковое отношение различных микробов к красителям трифенилметановой группы: генцианвиолету, метилвиолету, кристалвиолету. Микробы, входящие в группу грамположительных дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. Окрашенные микробы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микробы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные микроорганизмы образуют с генциан-, кристалл- или метилвиолетом и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет. Отношение микроорганизмов к окрашиванию по Грамму имеет большое диагностическое значение.
Подготовка микробной культуры

Высеивание микробной ультуры

Небольшое количество почвенной пробы следует высеять в чашки Петри с водорослевым агаром с помощью микробиологической петли, далее засеянные чашки Петри нужно выдержать при комнатной температуре в течение 9 дней. Также лучше сделать контрольный посев из воздуха, чтобы позже сравнить колонии микрооганизмов, выросших в разных чашках Петри, и знать какие микроорганизмы могли попасть из воздуха, а не из почвы.
Приготовление мазка

На чистое, обезжиренное предметное стекло поместить каплю дистиллированной воды, затем с помощью микробиологической петли в нее внести небольшое количество выросшей на агаре микробной культуры. Далее нужно сделать мазки и фиксировать их на пламени. Лучше сделать по 2- 3 мазка на каждый образец почвы и один контрольный мазок.
Окрашивание микроорганизмов

Окраску микроорганизмов по Граму следует производить следующим образом:

Мазок, фиксированный на огне, нужно окрашивать через фильтровальную бумагу основным красителем- раствором основного карболового кристалвиолета. Прокрашивание должно длиться 1-2 минуты.

Далее бумагу следует снять, избыток краски слить и налить раствор Люголя на 1-2 минуты до почернения препарата.

Далее раствор Люголя нужно опять слить, предметное стекло для обесцвечивания мазка погрузить несколько раз в стаканчик со спиртом; процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.

Затем препарат следует тщательно промыть водопроводной водой и докрасить спиртово-водным раствором фуксина в течение двух минут.

В конце мазок нужно промыть водой и высушить.
Результат окраски: грамположительные бактерии окрашиваются основной краской в темно- фиолетовый цвет, грамотрицательные бактерии, воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет.


  1. ^ Исследование бактерий на подвижность.

Mycoplasma mobile: подвижность

Феномен скользящей подвижности обнаружен только у 5 из 100 исследованных видов микоплазм: у M. gallisepticum , M. pneumoniae , M. genitalium , M. pulmonis и M. mobile . Наиболее выраженной скользящей подвижностью обладает M. mobile 163K, выделенная из жаберного аппарата линя - пресноводной рыбы Tinca tinca ( Kirchhoff, Rozengarten, 1984 ). Динамические характеристики "скольжения" нескольких микоплазм, в частности M. mobile, исследованы в серии работ с использованием цейтраферной микроскопии в темном поле ( Rosengarten et al., 1988 ; Kirchhoff, 1992 ). По материалам этих работ создан кинофильм, демонстрирующий движение M. mobile по влажной пластиковой подложке, хемотаксис и процесс образования микроколоний. С помощью киносъемки была определена скорость движения клеток пяти видов микоплазм ( табл. 5 ).
M. mobile по сравнению с другими микоплазмами и бактериями имеет несколько преимуществ для изучения процесса скользящей подвижности: 1) быстрое и стабильное скольжение (за одну секунду клетка преодолевает расстояние, в 4 раза превышающее ее собственную длину); 2) выраженная полярность клетки; 3) простая структура оболочки; 4) малое количество белков.
В работе японских авторов проведен детальный анализ движения M. mobile и охарактеризованы белки-мишени антител, ингибирующие движение этой микоплазмы ( Miyato et al., 2000 ). При движении клеток, скользящих в определенном направлении, обнаружено их покачивание (swing). Центр качания локализован в "головной" части клетки. Клетки старой культуры иногда расплываются и теряют способность к скольжению. Часть таких клеток оказывается сильно вытянутой, с тонким и удлиненным лидирующим концом. Это позволяет предположить, что движущая сила развивается именно на лидирующем конце клетки. При введении бусинок полистерола диаметром 0.2 мкм в культуру клеток микоплазм наблюдается движение части из них, прикрепившихся к клеткам. Прикрепление бусин слабо влияет на подвижность микоплазм, но сами бусины не перемещаются по поверхности клеток, вероятно потому, что верхняя поверхность клеток остается неподвижной.
Бактерии

БАКТЕРИИ (греч. bakterion палочка) - одноклеточные микроорганизмы с примитивным ядром без ядерной оболочки.
Бактерии широко распространены в природе. Они обитают в почве, воде, на растениях, в организме человека (см. Микробная флора человека) и животных. Нек-рые из них используются для получения биологически активных соединений, а также при изготовлении молочнокислых продуктов питания (см. Бактериальные препараты, Микробиологическая промышленность, Молоко, молочные продукты) и др. Сравнительно небольшая часть бактерий является возбудителями инф. болезней человека и животных.
В зависимости от формы бактерии делят на кокки, имеющие шаровидную форму; палочки; спириллы - спиралевидные извитые бактерии; вибрионы (см. Холера), имеющие вид изогнутых палочек; спирохеты - длинные извитые бактерии. Среди бактерий особые группы составляют риккетсии - облигатные внутриклеточные паразиты и актиномицеты - ветвящиеся грамположительные бактерии.
Многие бактерии образуют жгутики - нитевидные выросты белковой природы, идущие от цитоплазматической мембраны и пронизывающие клеточную стенку. Жгутики обеспечивают подвижность бактерий. Количество жгутиков у разных бактерий варьирует от одного (у возбудителей холеры) до десятка и сотен жгутиков, расположенных по периферии клетки - у возбудителей брюшного тифа, кишечной палочки (см. Эшерихия) и др. Наряду со жгутиками бактерии формируют и другие поверхностные структуры - ворсинки (пили, фимбрии), имеющие значение в проявлении вирулентных свойств (степень болезнетворности) бактерий в связи с адгезией - способностью прикрепляться к соответствующим клеткам макроорганизма.
Самой поверхностной структурой бактерии является капсула. Капсула состоит гл. обр. из полисахаридов. Она определяет ряд свойств бактерий, в частности их вирулентность, препятствует фагоцитозу бактерий. Капсула таких капсулообразующих бактерий, как пневмококки, клебсиеллы и др., хорошо выявляется в световом микроскопе после окраски специальными методами. Многие бактерии имеют так наз. микрокапсулу, видимую только в электронном микроскопе. Нек-рые бактерии образуют слизь, не имеющую в отличие от капсулы четких внешних границ.
Большинство бактерий (кроме микоплазм и так наз. L-форм бактерий) покрыты клеточной стенкой. Клеточная стенка - прочная упругая структура, обеспечивающая постоянство формы бактерий. Бактерии в зависимости от способности окрашиваться по методу Грама (см. Окраска микроорганизмов) разделяют на грамположительные и грамотрицательные формы, различающиеся по ряду важных биологических свойств (строение клеточной стенки, чувствительность к антибиотикам и др.). Наиболее толстой клеточной стенкой обладают грамположительные бактерии. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий имеет трехслойную внешнюю мембрану, где находятся так наз. О-антиген и эндотоксин (см. Токсины).
Под клеточной стенкой бактерий располагается периплазматическое пространство, к-рое отграничено с наружной стороны клеточной стенкой, а с внутренней - трехслойной цитоплазматической мембраной. Цитоплазматическая мембрана регулирует процессы проникновения различных веществ внутрь клетки и выход продуктов обмена в окружающую среду. Она содержит различные ферменты, в т. ч. ферменты дыхательной цепи. Цитоплазматическая мембрана окружает основную часть бактериальной клетки - цитоплазму. Цитоплазма состоит из мелких гранул - рибосом, участвующих в синтезе белка. Многие антибиотики, в частности аминогликозиды, подавляют функцию рибосом. При избыточном росте цитоплазматической мембраны образуются сложно устроенные мембранные структуры, к-рые располагаются в цитоплазме и называются внутрицитоплазматическими мембранными структурами, или мезосомами. В цитоплазме можно обнаружить также включения - зерна волютина, характерные, напр., для возбудителя дифтерии.
В центральной части бактериальной клетки находится ядро (нуклеоид), к-рое в отличие от ядер клеток растений и животных не имеет ядерной оболочки и ядрышка. Нуклеоид бактерий представлен хромосомой в виде двунитчатой ДНК, замкнутой в кольцо и плотно упакованной в виде клубка нитей ДНК. Деление нуклеоида предшествует делению бактериальной клетки.
Питательные потребности бактерий разнообразны. Нек-рые бактерии способны расти, используя простые соединения - углекислоту и ионы аммония, другие требуют наличия органических источников углерода и ряда сложных органических веществ, в т. ч. витаминов. Для роста бактерий необходимы достаточная влажность, оптимальное количество кислорода для аэробных бактерий (см. Аэробы) или полное его отсутствие для строгих анаэробов, напр, бактероидов, а также бактериальные факторы роста - вещества, к-рые бактерии самостоятельно синтезировать не способны. Отсутствие указанных компонентов в питательной среде приводит к остановке роста бактерий - бактериостазу. Бактерии, для роста к-рых необходимы факторы крови, называются гемоглобинофильными бактериями. Различные хим. вещества и факторы окружающей среды, напр, ультрафиолетовое излучение, высокая температура, оказывают на бактерии разрушающее, т. е. бактерицидное действие.
Нек-рые бактерии образуют споры, способные длительно сохраняться в неблагоприятных условиях (при высокой температуре, высушивании). Бактерии, формирующие споры, по величине не превышающие размеры образующих их клеток, называют бациллами в отличие от клостридий, споры у к-рых превышают по размеру вегетативные клетки.
Различные виды и подвиды бактерий отличаются по морфологическим, культуральным (особенности роста на питательных средах), биохимическим и антигенным свойствам. Антигенные свойства бактерий определяются способностью иммунных сывороток взаимодействовать с определенными антигенами бактерий. Антигены бактерий разделяют на несколько групп: жгутиковые (Н-антигены), капсульные (К-антигены, Vi-антигены), липополисахаридные (входящие в состав наружной мембраны - так наз. О-антигены) и др. Существуют групповые (общие для нескольких видов бактерий) и специфические (присущие только данному виду бактерий) антигены. Антигены бактерий, взаимодействуя с иммунной системой организма, способствуют образованию противоинфекционного иммунитета. Диагностика многих инф. болезней, вызываемых бактериями, основана на определении различных бактерий по их антигенам (см. Серологические исследования).
Способность бактерий вызывать инф. болезни называется патогенностью. Основой патогенности бактерий является их свойство образовывать в организме токсины. К факторам патогенности относятся и другие особенности бактерий (напр., наличие капсулы). При ослаблении защитных сил организма человека, при длительном лечении антибиотиками широкого спектра действия заболевание могут вызывать и обычные бактерии, напр, представители нормальной микрофлоры организма человека. Такие бактерии называются условно-патогенными (см. Условно-патогенные микроорганизмы). Условно-патогенные и патогенные бактерии способны вызывать гнойное воспаление локального (абсцесс) или генерализованного характера (септикопиемия). В этом случае их называют гноеродными бактериями.
В результате действия защитных сил организма, а также антибиотиков бактерии могут утрачивать клеточную стенку и превращаться в L-формы - мелкие сферические бактерии, чувствительные к изменению осмотического давления.



  1. Дополнительные исследования для обнаружения сальмонелл, анаэробов.


1.Люминесцентный метод обнаружения сальмонелл.

2.Из средней пробы берут 100 г корма, разводят стерильным физиологиче­ским раствором в соотношении 1:5 и выдерживают в термостате 6-8 часов при тем­пературе 37 С. Из полученной смеси готовят 2 мазка на обезжиренных стеклах нанесением суспензии бактериологической петлей на площадь 1 см2, обозначенную восковым карандашом на обратной стороне. Мазки высушивают на воздухе при ком­натной температуре или в термостате, фиксируют этиловым спиртом 15 минут и опо­ласкивают дистиллированной водой в течение 5-10 секунд.

3.На высушенные мазки, помещенные на мостик бактериологических чашек с влажным тампоном ( для предотвращения высыхания сыворотки), наносят 1-2 капли


влажной в
рабочего разведения люминесцирующей поливалентной сальмонеллезной сыворотки. При необходимости определения групповой принадлежности сальмонелл применяют групповые люминесцирующие сальмонеллезные сыворотки. Мазки выдерживают во ажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре или 15 минут термостате при 37 С. Затем мазки дважды по 10 минут промывают 0,15 М раст­вором хлористого натрия, ополаскивают дистиллированной водой и вновь высуши­вают.

4.Окрашенные мазки заключают в смесь, состоящую из 9 частей
глицерина


и 1 части 0,15 М раствора хлористого натрия, накрывают покровным стеклом, на которое наносят каплю - нефлюоресцирующего иммерсионного масла или диметилфта-лата, и просматривают под люминесцентным микроскопом.

5.Положительным результатом считается обнаружение сальмонелл, у ко-
торых отмечается сияющая или яркая флюоресценция зеленого цвета периферии
клеток с четко контрастируемой зоной по центру.


В качестве контроля берут сальмонеллезную культуру, наносят ее на предмет­ное стекло и к ней добавляют люминесцирующую сыворотку.
6.Исследования на энтеропатогенные типы кишечной палочки.
7. 50 г корма помещают в колбу, содержащую 500 мл стерильного


физиоло­гического раствора, встряхивают на шуттель- аппарате в течение 30 минут и из полу­ченной взвеси стерильными пипетками готовят разведения 1:100, 1:1000,

1:10000,

1:100000, 1:1000000. По 1 мл каждого разведения вносят в пробирки ( по выбору) со средами Эйкмана, Кесслера или Кода. Посевы помещают в термостат при темпе-ратуре 43 С для первых двух сред и при 37 С - для последней.

Через 24 часа учитывают рост: на среде Эйкмана - по помутнению среды и образованию газа, на средах Кесслера и Кода - по изменению цвета сред. Титр

кишечной палочки устанавливают по наибольшему разведению, в котором еще на­блюдался ее рост.

Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев на плотные дифференциально-диагностические среды Эндо, Левина в бактериологических чаш­ках, разделенных на секторы для каждого разведения.

Типичные колонии Е. coli характеризуются круглой формой, гладкой, выпук­лой или слегка приподнятой в центре поверхностью, ровными краями, розового, красного или малинового цвета с металлическим блеском или без него на среде Эндо

или черного цвета на среде Левина.

8.Выросшие изолированные колонии 5- формы ( не менее 4) пересевают на
МПБ, выдерживают в термостате при температуре 37 С в течение 16-24 часов.
После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посева
на


дифференциально- диагностические среды, заражения мышей; вторую - для при­готовления автоклавированного антигена, если кипяченый антиген не будет агглю­тинироваться поливалентными ( комплексными) коли- сыворотками.

У выделенных культур определяют морфологические и культурально- биохими­ческие свойства с целью проведения их родовой дифференциации, как указано в при­ложении 1.

Морфологию бактерий изучают в мазках, окрашенных по Граму, подвижность определяют по характеру роста в 0,3%-ном полужидком МПА.

9.Для определения культурально- биохимических свойств бактерий

-

зуют набор питательных сред, куда входят среды с углеводами и индикатором

Анд-

раде ( лактоза, глюкоза, сахароза, маннит, дульцит, аденит, инозит), среда Кларка,

нитратно-аммонийная среда, МПЖ, среда с мочевиной, МПБ или бульон Хоттингера и агар с глюкозой и сернокислым железом.

10.Патогенные свойства кишечной палочки определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах. С этой целью внутрибрюшинно заражают трех мышей массой 14-16 г смывом с суточных агаровых культур, в дозе 500 млн. микробных тел. Концентрацию бактерий устанавливают по бактерийному стандарту. Культуру признают патогенной в случае гибели одной или более мышей в первые четверо суток после заражения.

11.Одновременно с определением морфологических, культурально- биохи­мических и патогенных свойств бактерий проводят серологическую типизацию культур кишечной палочки по 0- антигену с целью установления энзоотических типов.

Для приготовления антигена каждую предназначенную для типизации суточ­ную агаровую культуру ( пробирка со скошенным агаром) смывают стерильным фи­зиологическим раствором, доводят суспензию бактерий до концентрации 5-6 млрд/ мл

и кипятят в водяной бане в течение 1 часа. Уровень воды должен быть выше уровня

культуры в пробирках.

На чистое обезжиренное стекло наносят пастеровской пипеткой по капле каж­дой комплексной О- сыворотки, разведенной физиологическим раствором 1 : 5, и по капле исследуемого антигена. Затем хорошо перемешивают стеклянной палочкой или петлей. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 3 минут при покачивании стекла.

В том случае когда антиген агглютинируется всеми комплексными сыворот-

а *х'ч^х"х ^*jxy*acLC x\.4^x',xxci. апхш ai'i'juu'ryinyiLjу сг^л o^*cxvxx'x x\.4^xvxxxjxcx\.^*xiaixvxx'x ^*аххэч^£^ч^'Х'

ками, его проверяют с физиологическим раствором для исключения самоагглютина­ции. Самоагглютинирующие антигены для серотипизации непригодны.

Антигены, давшие четко выраженную агглютинацию на стекле с комплексной коли- сывороткой, исследуют в капельной реакции агглютинации ( РА) с отдельными

ri^jiia ^xur5*_»^j*_»'.L'i4*_»ia, ja^^jxc^у xu'X' a Aaiicjicnuja L^ccLx^i-Liaja a.x'X'jxxu'X'j'xnci.xxi'xj'x

разведенными 1:10 типоспецифическими сыворотками, входящими в состав комплекс­ной сыворотки.

2.5.6. Если антиген из исследуемой культуры агглютинируется в капельной

РА

с одной или двумя-тремя моносыворотками, то его проверяют с этими же сыворот­ками в пробирочной РА, так как реакция на стекле имеет лишь ориентировочное значение.

Для постановки пробирочной РА типоспецифические О- сыворотки, агглютини­рующие антиген из исследуемой культуры в РА на стекле, разводят физиологическим

раствором, начиная с 1:100 до предельного титра сыворотки, указанного на эти­кетке, и во все пробирки добавляют по 2 капли антигена ( концентрация 5-6

млрд.

бактериальных тел по бактерийному стандарту), приготовленного из убитой нагре­ванием агаровой культуры обнаруженных бактерий.

1. Исследования на анаэробы.

1.1. 50 г корма растирают в стерильной ступке с физиологическим
растворам


и засевают в несколько пробирок со средой Китта- Тароцци, молоком и по две чашки со средами Вильсона - Блера и кровяным агаром по Цейслеру. Для уничто-ження вегетативных форм по одной пробирке с жидкими средами прогревают при тем­пературе 80 С в течение 20 минут. Посевы помещают в термостат при температуре 37 С. Чашки должны находиться в специальных аппаратах для анаэробных культур или в эксикаторе, куда заранее вносят тот или иной поглотитель кислорода.

1.2. Результаты посевов регистрируют в первый же день. Почернение среды
Кильсона - Клера в течение 1-3 часов после посева, свертывание молока с обра-
зованием ноздревато- губчатого сгустка и прозрачной сыворотки в течение 6
часов,


также быстрое начало роста на среде Китта - Тароцци ( через 4-5 часов) при обильном газообразовании является характерным для клостридиум перфрин-

а также быстрое начало роста на среде Китта - Тароцци ( через 4-5 часов) при о

генс.

Рост клостридиум ботулинум, наблюдаемый обычно на 2- З- й день, характери­зуется помутнением среды Китта - Тароцци, образованием осадка и запахом про­горк- того масла.

При обнаружении роста на среде Китта - Тароцци производят микроскопиче­ское исследование и выделение чистой культуры посевом на 2-3 чашки с кровяным агаром по Цейслеру, которые выдерживают в анаэробных условиях при темпера­туре 37 С в течение 24-48 часов, после чего просматривают рост в чашках и отби­рают культуры, которые классифицируют по морфологическим и биохимическим свойствам, указанным - в приложении 2.

Биологическую пробу проводят на морских свинках или белых мышах путем внутрибрюшинного заражения бульонной культурой. При положительном резуль­тате подопытные животные гибнут через 12-48 часов.

1.3. Для идентификации отдельных возбудителей или типов одного вида ставят опыт нейтрализации токсина специфической сывороткой. Для этого мини­мальную смертельную дозу культуры в смеси с 0,2-0,5 мл соответствующей типа­специфической сыворотки выдерживают в термостате 45 минут и вводят мышам внутрибрюшинно. Для контроля испытуемую культуру или фильтрат вводят мышам без сыворотки. Вид и тип микроба определяют по выживаемости мышей, получивших соответствующую сыворотку.

1.4. При исследовании кормов на ботулизм ( наличие токсинов) в качестве
подопытных животных используют белых мышей. При этом могут быть применены
два способа:


а) нейтрализация токсина противоботулиновой сывороткой ( антитоксином).
Корм предварительно растирают в ступке со стерильным физиологическим раство-
ром (1:4) и настаивают в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Настой
центрифугируют и фильтруют через ватно- марлевый фильтр. К 0,5 мл фильтрата
добавляют 0,2 мл поливалентной противоботулиновой сыворотки. Смесь выдержи-
вают 1 час при комнатной температуре, затем одному животному вводят подкожно
0,5 мл фильтрата, другому - смесь фильтрата с сывороткой в той же дозе.

Заключение

Источники инфицирования пищевых продуктов стафилококками и стрептококками весьма разнообразны. Одно из основных мест занимают животные(коровы, овцы), страдающие маститами и дающие заведомо зараженное этими микроорганизмами молоко. Нередко энтеротоксигенные штаммы стафилококков, а также стрептококков выделяют из туш и органов животных, вынужденно убитых с течением септикопиемических процессов, энтеритов, пневмоний. В настоящее время большое значение .придают экзогенному и аэрогенному обсеменению пищевых продуктов этими микроорганизмами. Экзогенное обсеменение возможно при первичной обработке пищевых продуктов лицами, страдающими гнойничковыми заболеваниями кожных покровов, и в первую очередь рук. Аэрогенное

обсеменение продуктов возможно лицами, больными ринитом и нозофарингитом.

При кашле и чихании стафилококки массивно инфицируют окружающую среду, в том числе и пищевые продукты.

Отличительная особенность развития токсикозов стафилококковой и

стрептококковой этиологии у людей — исключительно короткий инкубационный период, составляющий 2—6 ч. Клинически токсикоз протекает в виде острого гастроэнтерита со следующими симптомами: вскоре после приема инфицированной пищи появляются боли в животе, головная боль, слабость, тошнота и рвота, частый жидкий стул. При стафилококковом токсикозе возможен также подъемтемпературы до 38,5°С, упадок сердечной деятельности, судороги, цианоз губ,

носа и конечностей, ослабление зрения и даже потеря сознания с падением

кровяного давления.

Выздоровление обычно наступает через 1—3 дня (смертельные случаи в

литературе не отмечены).

Санитарная оценка продуктов при выделении токсигенных кокковых

микроорганизмов. При выделении из проб мяса и лимфатических узлов туши

токсигенных кокковых микробов внутренние органы подлежат технической

утилизации, а мясо обеззараживают проваркой или направляют для изготовления

колбасных хлебов. Готовые продукты, из которых выделены токсигенные

стафилококки и стрептококки, утилизируют.

Профилактика токсикозов стафилококковой и стрептококковой этиологии

слагается из комплекса ветеринарно-санитарных и гигиенических мероприятий.

^ Список литературы:

1. Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней. / Н. А. Семина. - М.: Медицина, 1999

2. Внутрибольничная инфекция. / Шерертц, Хэмптон, Ристуцина. - Под ред. Р. П. Венцела. - М.: Медицина 1990.

3. Внутрибольничная инфекция. / соавторами. - учебно-методическая пособия, Иркутск, 1999. - 32 с.

4. Дезинфекционное дело. / Гандельсман Берта Израиловна. - Под ред. И. И. Карон. - М.: Медицина, 1971

5. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В.И. Покровского. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. - стр.543-547

6. Медицинская микробиология. / Гл. ред. В.И. Покровсктй, О. К. Поздеев - М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1998. - стр. 631-656

7. "Медицинская энциклопедия" РАМН 2001 Russ Portal Company Ltd.

8. Санитарная микробиология и вирусология./ З. Н. Качемасова, С. А. Ефремова, А. М. Рыбакова - М.: Медицина, 1987. - 352 с.

9. "Справочник госпитального эпидемиолога". М.: Хризгостом, 1999

10. Эпидемиология внутрибольничной инфекций. / Р. Х. Яфаев, Л. П. Зуева. - Ленинград: Медицина, 1989

11. Эпидемиологические особенности внутрибольничных инфекции в районах Сибири и Крайнего севера. / Ратушняк С. С. - автореферат, Иркутск, 1999

12. Гиляров М. С. Биологический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия, 1983, 831 с.

13. Хоулт Дж. Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир, 1980, 496 с.

Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987, 567 с.

14. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: М. Медицина, 1972, 480 с.
Реклама:





Скачать файл (1020.5 kb.)

Поиск по сайту:  

© gendocs.ru
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации
Рейтинг@Mail.ru