Logo GenDocs.ru


Поиск по сайту:  


Курсовая работа - Концепция Мир РНК - файл 1.doc


Курсовая работа - Концепция Мир РНК
скачать (5405.5 kb.)

Доступные файлы (1):

1.doc5406kb.16.11.2011 08:12скачать

содержание

1.doc

Реклама MarketGid:
Содержание

Стр.

Введение 2

I. Современные представления, характеризующие концепцию

«Мир РНК» 2

I.1. Обратная транскрипция 2

I.1.1. Репликация теломерных участков эукариотических хромосом 3

I.1.2. Механизм обратной транскрипции 7

I.2. Функциональные возможности РНК 12

I.3. тмРНК 17

I.4. Интерференция РНК 20

I.5. Структура РНК-содержащих стрессовых гранул 24 I.6. Появление концепции «Мира РНК» 27

I.6.1. Рибозимы 27

I.6.2. Возникновение древнего мира РНК 30

Заключение 35

Список литературы 37


Введение

Почти полвека тому назад, в 1953 г., Д. Уотсон и Ф. Крик открыли принцип структурной (молекулярной) организации генного вещества - дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Структура ДНК дала ключ к механизму точного воспроизведения - редупликации генного вещества. Возникла новая наука - молекулярная биология. Была сформулирована так называемая центральная догма молекулярной биологии: ДНК → РНК → белок. Смысл ее состоит в том, что генетическая информация, записанная в ДНК, реализуется в виде белков, но не непосредственно, а через родственного полимера - рибонуклеиновую кислоту (РНК), и этот путь от нуклеиновых кислот к белкам необратим. Таким образом, ДНК синтезируется на ДНК, обеспечивая собственную редупликацию, то есть воспроизведение исходного генетического материала в поколениях; РНК синтезируется на ДНК, в результате чего происходит переписывание, или транскрипция, генетической информации в форму многочисленных копий РНК; молекулы РНК служат матрицами для синтеза белков - генетическая информация транслируется в форму полипептидных цепей. При этом возникает отчетливое впечатление о значительно более разнообразных функциональных возможностях рибонуклеиновых кислот по сравнению с ДНК, существование которой связано исключительно с необходимостью сохранения и передачи из по­коления в поколение наследственных признаков [3].

Рибонуклеиновые кислоты (РНК), присутствующие в клетках как про-, так и эукариот, бывают трех основных типов: информационная (матричная, мРНК), транспортная (тРНК) и рибосомная (рРНК). В ядре клеток эукариот содержится РНК четвертого типа - гетерогенная ядерная РНК (гяРНК). У некоторых вирусов РНК служит носителем генетической информации.

^ I. Современные представления, характеризующие концепцию

«Мир РНК»

I.1. Обратная транскрипция

Современные знания о структурном и функциональном разнообразии РНК уже не укладываются в те канонические представления об их роли в реализации генетической информации, которые возникли в са­мом начале развития молекулярной биологии. Представление о том, что РНК служит только инструментом трансформации гене­тической программы (генотипа), заложенной в структуре ДНК, в конкретный фенотип, формируемый разнообразием белков, было в значительной мере разрушено после открытия обратной транскрипции. Оказалось, что РНК может слу­жить матрицей не только для воспроизведения своей собственной структуры в РНК-содержащих вирусных геномах, но и для биосин­теза ДНК у высших организмов. Этот процесс также используют в ходе своего развития многие вирусы, в том числе печально известные онкогенные вирусы и ВИЧ-1, вызывающий СПИД. РНК выполняет роль матричной молекулы в процессах об­ратной транскрипции (биосинтезе ДНК на матрице РНК) и своей собственной репликации у РНК-содержащих вирусов и фа­гов. В процессе обратной транскрипции роль затравки, необходи­мой для синтеза комплементарной цепи ДНК, выполняет тРНК. Матричные свойства РНК реализуются в процессе наращивания теломерных повторов в молекулах ДНК: РНК-матрица является важнейшим компонентом теломераз — ферментов, осуществляю­щих синтез теломерных участков ДНК в хромосомах.


^ I.1.1. Репликация теломерных участков эукариотических хромосом

На концах хромосом эукариот находятся специализированные повторяющиеся последовательности ДНК, получившие название теломерной ДНК, а содержащие ее концы хромосом — теломероми. В клетках животных количество хромосом, а следовательно, и те­ломерных участков невелико — они составляют лишь небольшую часть от всех остальных последовательностей.

Использование в качестве объекта исследования теломерной ДНК ресничной инфузории Tetrahymena thermophila, в клетках которой находятся десятки тысяч мелких хромосом, а следова­тельно, и множество теломер, показало, что теломеры построе­ны из коротких (содержат по 6 — 8 нуклеотидных остатков) мно­гократно повторяющихся последовательностей (блоков). При этом одна цепь ДНК обогащена остатками гуаниловой кислоты (G-богатая цепь, у тетрахимены — это блок ТТGGGG), а комплемен­тарная ее цепь обогащена остатками цитидиловой кислоты (С-богатая цепь). Теломерная ДНК человека построена из ТТАGGG-блоков, т.е. отличается от простейших всего лишь одним нуклеотидом в повторе. Из ТТАGGG-блоков построены теломерные ДНК (их богатые С-цепи) всех млекопитающих, рептилий, амфибий, птиц и рыб. Универсален и теломерный повтор (ТТТАGGG) у всех растений.

Теломеры играют важную роль в создании специфической архитектуры и внутренней упорядоченности клеточного ядра. Они предотвращают деградацию и слияние хромосом, а также ответ­ственны за их прикрепление к специальной внутриклеточной структуре (своеобразному скелету клеточного ядра).

Механизмы репликации теломерных участков эукариотических хромосом и центральных областей ДНК принципиально различа­ются. Все известные ДНК-полимеразы, являющиеся ферментами сложного репликативного комплекса эукариот, неспособны пол­ностью реплицировать концы линейных молекул ДНК. Известно, что ДНК-полимеразы, синтезируя дочернюю нить ДНК, прочи­тывают родительскую нить в направлении от ее З'-конца к 5'-концу. Соответственно дочерняя цепь синтезируется в направлении 5'→3'. Кроме того, ДНК-полимераза начинает синтез только со специального РНК-праймера, комплементарного ДНК. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются, а пропуски в одной из дочерних цепей ДНК (отстающей) заполняются ДНК-полимеразой β. Однако на З'-концевых участках ДНК такой про­пуск заполнен быть не может, и поэтому они остаются однотяжевыми, а их 5'-концевые участки — недореплицированными. Следовательно, при каждом раунде репликации хро­мосомы будут укорачиваться на 10—20 нуклеотидов (у разных ви­дов размер РНК-затравок различен), и в первую очередь сокра­щать длину теломерной ДНК. Возникла проблема «концевой недорепликации ДНК». В случае репликации кольцевых бактериаль­ных ДНК этой проблемы не существует, так как первые по вре­мени образования РНК-праймеры удаляются ферментом, кото­рый одновременно заполняет образующуюся брешь путем нара­щивания З'-ОН-конца растущей цепи ДНК, направленной в «хвост» удаляемому праймеру. Проблема недорепликации З'-концов линейных молекул решается эукариотическими клетками с помощью специального фермента — теломеразы. Этот фермент был обнаружен впервые в 1985 г. у инфузории Tetrahymena thermophila, а впоследствии — в дрожжах, растениях и у животных, в том числе в яичниках человека и бессмертных лини­ях раковых клеток НеLа.

Теломераза является ДНК-полимеразой, достраивающей 3'-концы линейных молекул ДНК хромосом короткими (6 — 8 нук­леотидов) повторяющимися последовательностями (у позвоноч­ных ТТАGGG). Согласно номенклатуре, этот фермент называют ДНК-нуклеотидилэкзотрансферазой, или теломерной терминальной трансферазой (мол. масса 103—133 кДа). Помимо белковой части теломераза содержит РНК, выполняющую роль матрицы для наращивания ДНК повторами.

Длина теломерной РНК колеблется от 150 нуклеотидов — у про­стейших до 1400 нуклеотидов — у дрожжей, у человека — 450 нук­леотидов. Наличие в молекуле теломеразы РНК-последователь­ности, по которой идет матричный синтез фрагмента ДНК, поз­воляет отнести теломеразу к своеобразной обратной транскриптазе, т.е. ферменту, способному вести синтез ДНК по матрице РНК. Основное назначение теломеразы — синтезировать тандемно по­вторяющиеся блоки ДНК, из которых состоит G-цепь теломерной ДНК. Матричный участок представлен в теломеразной РНК только один раз. Его длина не превышает длину двух повторов в теломерной ДНК.

Механизм синтеза теломерных повто­ров, катализируемый теломеразой:

На первой ста­дии (связывание теломеры) происходит комплементарное взаимодействие части матричного участка теломеразной РНК с 3'-концевым выступающим одноцепочечным сегментом ДНК хро­мосом. При этом З'-концевой фрагмент ДНК служит затравкой для удлинения этой ДНК на РНК-матрице. На стадии элонгации выступающая цепь ДНК удлиняется до конца матрицы. Эта реак­ция осуществляется РНК-зависимой ДНК-полимеразной актив­ностью теломеразы.

После удлинения выступающей цепи ДНК до конца матрицы происходит транслокация, т.е. перемещение матрицы и белковых субъединиц фермента на заново синтезированный конец теломе­разной ДНК, и весь цикл повторяется вновь. После завершения удлинения одноцепочечной З'-концевой теломерной последова­тельности вторая цепь ДНК (С-цепь) достраивается с помощью обычной ДНК-полимеразы. Таким образом происходит решение проблемы концевой репликации ДНК у эукариот [1].



Рис. 1. Репликация теломерных участков эукариотических хромосом (Цитировано по [1]):

А — возникновение недореплицирования 5'-конца линейной хромосомы и син­тез на этом концевом участке теломерной ДНК с помощью теломеразы;

Б — основные этапы синтеза теломерного повтора теломеразой


^ I.1.2. Механизм обратной транскрипции

На обратной транскрипции основано размножение ретровирусов (вирусы, у которых геномом служит не ДНК, как обычно, а РНК) и ретротранспозонов (являются транспозиционными элементами, которые не имеют вирионных частиц, и, следовательно, в отличие от ретровирусов, не могут независимо «переносить себя» между клетками), образование так называемых ретропсевдогенов (или процессированные псевдогены это ретропоследовательности, которые потеряли свою функцию, они несут все признаки функциональных ретропоследовательностей, но имеют молекулярные дефекты, которые не дают им экспрессироваться) и достройка кончиков хромосом (теломер), укорачивающихся при каждом клеточном делении. Если молекула ДНК повреждена — например, подверглась разрыву (double-strand break, DSB) — для ее починки необходима матрица, в которой последовательность нуклеотидов соответствует исходному, «правильному» состоянию поврежденного участка. Ранее считалось, что в качестве таких матриц всегда используются другие молекулы ДНК. Позже было установлено, что иногда эти ДНК-матрицы синтезируются путем обратной транскрипции на основе РНК при участии ретротранспозонов.

При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК, было обнаружено, что в процессе внутриклеточного развития ретровирус проходит стадию интеграции своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клетки-хозяина. В 1964 г. Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного фермента, способного синтезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК. Усилия, направленные на выделение такого фермента, увенчались успехом, и в 1970 г. Темин с Мизутани, а также независимо от них Балтимор открыли искомый фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза.

Каждый вирион (полноценная вирусная частица, состоящая из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки) ретровирусов содержит две идентичные цепи РНК размером от 8000 до 10 000 нуклеотидов. Области 5'- и 3'-концов обеих цепей модифицированы, как у всех эукариотических мРНК (5'-кэпы, З'-полиадениловые хвосты). Вирусные РНК име­ют 5 структурных элементов: 1) прямые повторы на 5'- и З'-концах РНК (R); 2) последовательность из 80—120 нуклеотидов, нахо­дящуюся около 5'-концевого повтора (U5); 3) последовательность из 170—1200 нуклеотидов — около З'-концевого повтора (U3); 4) последовательность из 15—20 нуклеотидов (Р), в пределах кото­рой клеточная тРНК комплементарно взаимодействует с ретровирусной РНК, что создает праймер для синтеза первой цепи ДНК; 5) сегмент Pu, находящийся непосредственно перед повтором U3 и являющийся сайтом для праймирования второй цепи ДНК — такой сегмент одинаков у РНК всех ретровирусов определенного типа.

Этапы обратной транскрипции:

1. Наращивание тРНК-праймера на матрицах U5 и R в направлении 3'→5'. Роль РНК-праймера выполняет одна из кле­точных тРНК (например, триптофановая, пролиновая и т.д.). На расстоянии примерно 100—200 нуклеотидов от 5'-конца РНК (для каждого вируса — это величина постоянная) имеется участок, комплементарный З'-концевой последовательности молекулы тРНК, который используется в качестве затравки. Этот участок обычно обозначают как pbs (от англ.primer binding site — участок связывания затравки). Обратная транскриптаза синтезирует сегмент ДНК, комплементарный 5'-концевой последовательности вирусной РНК. Этот сегмент принято называть (-) «strong-stop» ДНК, поскольку синтез ДНК после завершения копирования 5'-конца матрицы временно останавливается. (-) «strong-stop» ДНК содержит последовательности, комплементарные концевому рай­ону R и району U5. Таким образом, синтез ДНК начинается недалеко от 5'-конца матрицы и образуется короткий продукт. Но этот короткий продукт (-) «strong-stop» имеет последовательность, комплементарную так­же и З'-концу вирусной РНК, а как известно, для снятия ДНК-копии с З'-конца матрицы всегда требуется праймер. У ретровиру­сов комплемент З'-конца матрицы производится в «удобном» ме­сте, а затем переносится на «свое» место. Это происходит следую­щим образом: 5'-конец вирусной РНК, образующий дуплекс с (-) «strong-stop» ДНК, разрушается под влиянием присущей обрат­ной транскриптазе активности РНКазы Н.

2. РНКаза Н, специфичная к РНК в составе гибридно­го РНК-ДНК-дуплекса, расщепляет сегмент РНК этого дуплекса. В результате (-) «strong-stop» (RU5) оказывается в однонитевой форме и может взаимодействовать с З'-концом (с участком R) той же самой или другой молекулы вирусной РНК, поскольку на З'-конце РНК имеется повтор R..

3. Новосинтезированная короткая цепь ДНК вместе с праймером «перепрыгивает» на З'-конец матрицы и взаимодей­ствует там с комплементарным ей участком К.

4. Цепь ДНК удлиняется, в качестве матрицы использу­ется остальная часть вирусной РНК. На этой стадии в качестве затравки выступает уже (-)«strong-stop» ДНК; элонгация за­травки приводит к синтезу (-) цепи ДНК, в которой отсутствует комплемент района RU5, поскольку соответствующий участок (+) матрицы был разрушен РНКазой Н.

5. К моменту завершения синтеза первой цепи ДНК боль­шая часть вирусной РНК разрушается РНКазой Н.

6. Синтез З'-конца второй цепи ДНК.

7. Удаление тРНК и оставшегося участка вирусной (+) РНК РНКазой Н.

8. Второй прыжок, в результате которого новосинтезиро­ванная вторая цепь ДНК комплементарно взаимодействует с тРНК-связывающей последовательностью первой цепи.

9. Удлинение З'-концов каждой цепи, образование дуп­лекса ДНК.

Вся последовательность реакций протекает без явного участия ферментов репликации клетки-хозяина (топоизомеразы, хеликазы, праймазы, ДНК-связывающего белка, лигазы и т.д.). При этом следует отметить, что молекулы вирусных ДНК длиннее молекул вирусных РНК, которые послужили матрицей для обратной транскрипции. Действительно, к 5'-концу (+) цепи вирусной ДНК добавилась последовательность U3, а к 3 -концу этой цепи — последовательность U5. В результате на концах моле­кулы вирус-специфической ДНК появился длинный (несколько сотен нуклеотидов) концевой повтор (ДКП или LTR.), имеющий структуру U3U5 [ 1].



Рис.2. Схема обратной транскрипции ретровирусной РНК с образованием двуцепочечной ДНК (Darnell J., et.al. // Molecular Cell Biology. – N. Y.: Scientific Amer. Books, 1986. – P. 1052)

Синтез ДНК на РНК-матрице in vitro и ревертаза используется в генети­ческой инженерии для синтеза генов и их фрагментов, а также целенаправленного синтеза на матричных РНК комплементарных молекул ДНК (кДНК) для расшиф­ровки первичной структуры РНК и белков.



Рис. 3. Схема получения кДНК с использованием ревертазы вируса и трех дополнительных ферментов: поли (А)-полимеразы, фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и нуклеазы S1. (Цитировано по [1])

Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. В качестве праймера при обратной транскрипции поли (А) - содержащих мРНК используют олигo (dT)-праймер, а для молекул РНК, не имеющих З'-поли (А) концов, — химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З'-концу изучаемой РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3'-концах одноцепочечных кДНК самокомплементарные шпильки, которые могут выполнять функции праймера. Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано, что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. сoli (остающаяся часть молекулы, которая сохраняет присущие ей каталитические активности).

Уже одно это открытие формаль­но поставило РНК в центр основного постулата молекулярной генетики, так как показало, что поток генетической информации распространяется от РНК не в одном, а в двух направлениях: не только к белку, но и к ДНК. Все более глубокое проникновение в механизмы основных молекулярно-генетических процессов (реп­ликацию, транскрипцию и трансляцию) способствовало возник­новению понятия о неканонических функциях РНК, осознанию по­лифункциональности рибонуклеиновых кислот.



^ I.2. Функциональные возможности РНК

Для того чтобы оценить значение РНК в природе в целом, следует попытаться ответить на вопрос: что могут РНК?

К достаточно давно определенным каноническим функциям РНК относятся: способность выполнять роль мессенджера при пе­редаче наследственной информации о структуре белка от ДНК к белоксинтезирующему аппарату клеток (мРНК), участвовать в формировании структуры рибосом (рРНК), обеспечивать специ­фическое акцептирование и перенос аминокислот к рибосомам (тРНК).

Вместе с тем РНК свойственны особые неканонические функ­ции, реализуемые на разных этапах программы жизни тех или иных организмов.

В биосинтезе белка (трансляции) РНК безусловно играет опре­деляющую роль. Различные по структуре рРНК формируют основу субчастиц рибосомы и определяют взаимодействие субчастиц при сборке полной рибосомы. Присоединение мРНК к рибосоме детер­минируется комплементарным взаимодействием определенных уча­стков мРНК и рРНК. Активация аминокислот, их специфическое акцептирование и доставка к рибосомам осуществляется тРНК. Кодон-антикодоновое взаимодействие между мРНК и тРНК обеспе­чивает перевод нуклеотидной последовательности информацион­ных макромолекул в аминокислотную последовательность синте­зируемых белков. Сама реакция образования пептидной связи (транс-пептидирование) и продвижение рибосомы по мРНК (транслока­ция) также, по всей видимости, связаны с функционированием рРНК. Пространственная структура мРНК непосредственно влияет на скорость трансляции, а ее способность взаимодействовать с раз­нообразными регуляторными белками, особенно характерная для высших эукариот, является

основой для тонкой регуляции биосин­теза белка.


Рис. 4. Общая схема биосинтеза белка (Цитировано по Спирину А.С.)

При «включении» гена происходит локальное расплетение спирали ДНК. Затем с гена, кодирующего белковую молекулу, синтезируется его РНК-копия. После ряда «превращений» она становится матричной РНК, т. е. матрицей для синтеза белка. мРНК переносится из ядра клетки в цитоплазму, где связывается с рибосомами, на которых и «производится» белок. Он синтезируется из активированных аминокислот, присоединенных к специальным транспортным РНК.

В процесс трансляции вовлечено множество макромолекул и макромолекулярных комплексов. При трансляции происходит считывание генетической информации, заключенной в мРНК, рибосомами и ее передача полипептидным цепям белков, т.е. биосинтез полипептидных цепей, последовательность аминокислот в которых определена последовательностью нуклеотидов в мРНК в соответствии с генетическим кодом.

Свободные аминокислоты не узнаются рибосомами. Чтобы это произошло, аминокислоты должны поступать в рибосомы в виде конъюгатов с тРНК (аминоацилированных тРНК), последовательности нуклеотидов которых распознаются аппаратом трансляции. В каждой молекуле тРНК имеется участок из трех нуклеотидов, комплементарный кодону мРНК. Именно эта последовательность, называемая антикодоном, определяет положение аминокислоты в полипептидной цепи. В ходе каждого индивидуального акта трансляции рибосома распознает кодон мРНК и в соответствии с ним выбирает аминоацилированную тРНК, антикодон которой соответствует транслируемому кодону. После этого происходит соединение посредством пептидной связи очередной аминокислоты с С-концевой аминокислотой растущей цепи полипептида.

Таким образом, во время трансляции рибосома после связывания мРНК начинает последовательно, кодон за кодоном, перемещаться вдоль матрицы, выбирая из окружающей среды молекулы аминоацилированных тРНК. При этом каждый индивидуальный акт трансляции завершается присоединением выбранной молекулы аминокислоты к С-концевой аминокислоте синтезируемой цепи белка посредством пептидной связи.

Процесс биосинтеза белка рибосомами, как и биосинтез любой другой макромолекулы клетки, условно разделяют на три этапа: инициацию, элонгацию и терминацию.

Во время инициации трансляции происходит сборка нативной 70S или 80S рибосомы на транслируемой мРНК и подготовка к образованию пептидной связи между первыми двумя N-концевыми аминокислотными остатками синтезируемого полипептида.

При элонгации происходит последовательное удлинение растущей цепи полипептида аминокислотными остатками, а терминация трансляции сопровождается прекращением синтеза полипептида и его высвобождением из трансляционного комплекса. При этом наблюдается разделение рибосомы и мРНК, после чего они вступают в новый цикл трансляции.

В ходе трансляции рибосома последовательно перемещается вдоль транслируемой молекулы мРНК, считывая заключенную в ней генетическую информацию в виде триплетного генетического кода. Трансляция начинается в 5'-концевой части мРНК, а завершается в ее 3'-концевой части. При этом биосинтез полипептида начинается с его N-концевой аминокислоты [3].

РНК участвуют в репликации ДНК, выступая в роли затравок (праймеров), необходимых для инициации синтеза комплемен­тарных цепей ДНК. Особая «антисмысловая» РНК (РНК I) вы­полняет роль регулятора инициации репликации ДНК в точках начала репликации, обладая возможностью связывать праймеры и тем самым останавливать биосинтез ДНК.

В процессе транскрипции (биосинтезе РНК на матрице ДНК) большое значение имеет способность РНК образовывать разнообраз­ные элементы вторичной структуры (шпильки), которые влияют как на инициацию, так и на терминацию синтеза РНК. РНК актив­но участвует в процессе своего собственного созревания — процессинге первичных транскриптов (про-РНК). У примитивных одно­клеточных организмов выявлена способность РНК к аутостайсингу — вырезанию некодирующих участков (интронов) и сшиванию кодирующих фрагментов (экзонов) без участия белков-ферментов. У организмов, утративших способность к аутосплайсингу, в сплайсировании РНК тем не менее принимают участие особые молеку­лы — малые ядерные РНК (мяРНК), необходимые для безошибоч­ного вычленения интронов из молекул РНК-предшественников [1].

Посттрансляционные модификации синтезированных в ходе трансляции полипептидов, в результате которых образуются фун­кционально активные молекулы, также нередко сопряжены с присоединением к ним значительных по размерам молекул РНК. Таким путем возникают РНК-содержащие ферменты — рибонуклеопротеины - комплекс РНК и белка; среди рибонуклеопротеинов наибольшей функциональной значимостью обладают информосомы, а также РНП-частицы, участвующие в процессинге мРНК (сплайсомы, РНКаза и др.), теломеразы.

Информосомы, частицы, присутствующие в животных клетках и состоящие из высокомолекулярной (нерибосомной) рибонуклеиновой кислоты (РНК) и особого белка. Информосомы обнаружены впервые советским биохимиком А. С. Спириным с сотрудниками в 1964 в цитоплазме зародышей рыб, где они представлены смесью частиц разных размеров Отношение массы РНК к массе белка в информосомах постоянно (около 1:4) и одинаково у всех частиц, независимо от их размера. Аналогичные частицы найдены в клетках млекопитающих, в том числе зараженных вирусами, а также у иглокожих и насекомых. В них содержится, по-видимому, информационная РНК (иРНК) - отсюда название. Белок информосом служит, вероятно, для переноса иРНК из ядра в цитоплазму, а также для защиты иРНК от разрушения и регуляции скорости белкового синтеза.

Малые ядерные РНК присутствуют в ядрах в комплексах с бел­ками, получившими название малые рибонуклеопротеиновые части­цы (мяРНП). Стабильным компонентом мяРНП является белок фибрилларин — очень консервативный по структуре белок с молеку­лярной массой 34 кДа, локализованный в ядрышках. Комплекс, состоящий из множества мяРНП, который катализирует сплай­синг ядерных про-мРНК, носит название сплайсингосомы. Сплайсингосома собирается на интроне перед его выщеплением и содер­жит несколько различных мяРНП. Малые ядерные РНП собира­ются в сплайсингосомы в определенной последовательности.

И наконец, нельзя обойти вниманием тот факт, что многие катализаторы белковой природы (ферменты), катализирующие различные биохимические превращения в клетке, функциониру­ют благодаря содержанию в них коферментов рибонуклеотидной природы (NAD, FAD, АТР и др.) [1].


^ I.3. тмРНК

Помимо основных видов РНК существует особый вид - тмРНК (10Sа РНК) - небольшая стабильная молекула, совмещающая в себе свойства транс­портной и матричной РНК. Хотя тмРНК была открыта более 20 лет на­зад в пост-рибосомном супернатанте, полученном из клеток Escherichia coli ее функция была ус­тановлена только в 1996 году. тмРНК Е. coli состоит из 363 н. В современной модели вторичной структуры тмРНК Е. coli, основанной на сравни­тельном филогенетическом анализе нуклеотидных последовательностей тмРНК из 50 организмов, можно выделить три района. Первый включает 3'- и 5'-концы молекулы и образует тРНК-подобную структуру, состоящую из аминоакцепторного стебля и ТΨС-шпильки. Второй район представляет собой одноцепочечный участок, кодирую­щий tag-пептид, а третий соединяет тРНК - и мРНК-подобные части молекулы. Этот район сильно структурирован и содержит четыре псев­доузла (рк1, рк2, рк3 и рК4).

Матричная часть тмРНК кодирует пептид, являющейся сигналом узнавания специфическими протеазами (tag-пептид). тРНК-подобная часть может быть аминоацилирована. В аминоацилированном состоянии тмРНК взаимодействует с рибосомой, запрограммированной мРНК, в которой в результате случайной дегра­дации отсутствует стоп-кодон. В результате та­кие рибосомы оказываются "арестованными", они не могут освободиться от мРНК, тРНК и пептида и не могут участвовать в трансляции нужных клетке мРНК. После взаимодействия с тмРНК трансляция переключается на матричную часть этой РНК, что приводит к считыванию tag-пептида, кодируемого матричной частью мРНК. В ре­зультате tag-пептид присоединяется к недосинтезированному пептиду, который содержится в рибосоме до ее взаимодействия с тмРНК. При этом происходит терминация трансляции на стоп-кодоне матричной части тмРНК, а пептид, освободив­шийся из рибосомы, содержит участок, узнавае­мый специфическими протеазами, что способст­вует его быстрой деградации.



Рис. 5. Схема транс-трансляции (Цитировано по Зверевой М.Э. и соавт.)

В 1996 г. Кейлер предложил в качестве меха­низма функционирования тмРНК модель транс-трансляции (биосинтез полипептидной цепи белка с использованием различных матричных последовательностей). Она предлагает механизм синтеза дополни­тельного пептида, основанный на наблюдении, что добавление нового пептида происходит в слу­чае трансляции мРНК, в которой отсутствует стоп-кодон. Согласно этой модели, заряженная аланином тмРНК входит в А-центр рибосомы тогда, когда трансляция останавливается на З'-конце повреж­денной мРНК, не содержащей стоп-кодон. Оста­новившаяся пептидная цепь переносится на аланил-тмРНК (реакция транспептидирования), и рибосома продолжает синтез по матричной части тмРНК. Синтез продолжается до поступления в А-центр стоп-кодона тмРНК, после чего вступает в действие фактор терминации и трансляция завершается. В результате гибрид­ный белок, состоящий из пептидов, соединенных аланином из тмРНК, уходит из рибосомы, а освободив­шаяся рибосома может участвовать в синтезе другого белка.

Особенность такой транс-трансляционной си­стемы состоит в том, что одна пептидная цепь синтезируется с двух различных молекул мРНК. Необходимо отметить, что способ уста­новления рамки считывания (ОРС) матричной части тмРНК отличен от всех известных способов уста­новления рамки считывания. Первая включаемая аминокислота не определена обычным кодон-антикодоновым взаимодействием, а аденозиновый остаток, отстоящий на 3 н. в 5'-направлении от первого транслируемого кодона, важен для транс-трансляции. В природных тмРНК этот аденозин находится в центре таких триплетов, как UАА и UАG, которые обычно узнаются с по­мощью фактора терминации. Возможно, для ус­тановления правильной ОРС тмРНК необходим фактор терминации. Это предположение требует дальнейшего экспериментального под­тверждения.

С помощью тмРНК клетка решает две задачи: с одной стороны, осво­бождаются остановившиеся рибосомы, а с другой, неправильные белки быстро расщепляются специфической протеазой, узнающей сигналь­ный пептид, кодируемый матричной частью тмРНК. тмРНК активно исследуется на протяже­нии последних лет. Это связано с открытием процесса транс-трансляции, а именно с возможно­стью синтеза одного белка на основе двух различ­ных мРНК. Способность тмРНК объединять в од­ной молекуле функции тРНК и мРНК и присоеди­нять аланин из тРНК-части без обычного кодон-антикодонового взаимодействия делает тмРНК интересным объектом исследований. Кроме того, отсутствие тмРНК у высших организмов указывает на возможность ее использования в ка­честве хорошей мишени при создании новых ан­тибактериальных средств. Функция тмРНК осо­бенно важна для жизнедеятельности бактерий при повышенных температурах. Известно, что многие бактериальные инфекции сопровождают­ся повышением температуры, поэтому создание препарата, блокирующего функцию тмРНК, при­ведет к гибели бактерий и не повлияет на биосин­тез белков человека [8].

^ I.4. Интерференция РНК

Одним из наиболее важных механизмов регуляции экспрессии генов является интерференция РНК. Регуляция экспрессии эукариотических генов может осуществляться на нескольких уровнях: во время транскрипции, на стадии процессинга РНК, при трансляции и на уровне созревания белка. В последнее время в связи с открытием явления ин­терференции РНК большое внимание ученых привлекает посттранскрипционный уровень ре­гуляции.

Интерференция РНК - высокоспецифичный механизм подавления экспрессии гена на пост­транскрипционном уровне за счет деградации считанной с него мРНК. Деградация мРНК про­исходит в результате комплементарного связыва­ния комплексов, содержащих малые интерфери­рующие РНК (siРНК), которые относятся к се­мейству малых РНК, и белки, в том числе эндонуклеазы. Малые РНК - регуляторные неко­дирующие РНК размером от 19 до 28 н., образую­щиеся в клетке из более длинных двухцепочечных РНК (дцРНК). Малые РНК могут регулировать экспрессию генов не только посредством интерференции, но также подавляя трансляцию, транскрипцию или способ­ствуя удалению гена-мишени из клеточного генома. Последнее наблюдается у некоторых прос­тейших в процессе созревания макронуклеуса. Феномен интерференции РНК обнаружен у раз­личных эукариотических организмов, в частнос­ти, у одноклеточных, низших грибов, растений, нематод, насекомых, а также у позвоночных, включая мышей и человека. Подобная высо­кая консервативность механизма интерференции РНК свидетельствует о его большой значимости. И хотя функции некоторых видов малых РНК до сих пор не установлены, предполагают, что основная их роль - защита генома клетки от внедре­ния мобильных генетических элементов (вирусов, транспозонов), а также участие в регуляции дифференцировки многоклеточных организмов.

Малые РНК представляют значительный ин­терес для фундаментальной молекулярной био­логии и таких прикладных ее областей, как био­медицина и биотехнология. Одним из наиболее эффективных способов изучения функции гена является анализ фенотипа организмов, у которых этот ген не экспрессируется. Существует ряд ме­тодов, позволяющих подавлять экспрессию опре­деленных генов, в том числе, использование антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов, хими­ческих блокаторов, а также разрушение нужного гена во всем организме путем внесения соответст­вующих мутаций в зиготу. Однако эти методики либо сложны, либо не всегда эффективны и не обеспечивают полного сайленсинга гена (т.е. по­давления экспрессии) в экспериментальных моде­лях млекопитающих. В отличие от перечислен­ных методик, технологии, основанные на явлении интерференции РНК (деградация мРНК при вве­дении в клетку соответствующих им 81РНК или экспрессирующих их конструкций), просты в ис­полнении, эффективны и обладают большой спе­цифичностью распознавания молекулы-мишени.

Выделяют два основных типа малых регуляторных РНК: малые интерферирующие РНК (siРНК) и микроРНК (miРНК). Биохимически и функционально это молекулы практически неразличимы, и принцип их подраз­деления основан на природе предшественников.

siРНК - малые дцРНК длиной 19-25 п.н. обра­зуются из длинных дцРНК.

miРНК - малые оцРНК длиной 18-24 н. образу­ются из внутримолекулярных двухцепочечных структур (шпилек) РНК-предшественниц, транс­крибируемых с генов, содержащих повторяющиеся инвертированные последовательности (палин­дромы).

По происхождению малые РНК можно разде­лить на экзогенные (индуцируемые или кодируемые вирусами, либо введенные искусственно) и эндогенные (образующиеся при транскрипции собственных генов клетки).

Сигналом для инициации интерференции РНК служит появление в клетке экзогенной (вирусной или введенной в ходе эксперимента) либо эндо­генной (транскрибированной с собственных ге­нов клетки) дцРНК. Эффективность интер­ференции РНК прямо зависит от длины молеку­лы дцРНК: чем длиннее дцРНК, тем больше siРНК образуется, и тем большее число сайтов-мишеней на молекуле мРНК будет распознано. Минимальный размер дцРНК, достаточный для индукции интерференции, - 26 п.н. Ско­рее всего, такое ограничение защищает от дегра­дации собственную клеточную мРНК с короткими внутримолекулярными самокомплементарными структурами. дцРНК распознается и нарезается ферментом Dicer. Молекула Dicer содержит N-концевой хеликазный домен - РАZ, функция которого не совсем ясна, парные РНКазные домены, а также распо­ложенный на С-конце домен, необходимый для распознавания и связывания дцРНК. Предпо­лагают, что расщепление дцРНК у млекопитаю­щих осуществляется последовательно с одного конца молекулы. При этом происходит АТР-зависимая транслокация Dicer вдоль молекулы дцРНК.

В результате работы Dicer образуются двухцепочечные siРНК длиной 20-25 п.н. (видоспецифический признак). Эти молекулы содержат гидроксильные группы на З'-концах и фосфатные на 5'-концах, а также по два выступающих неспа­ренных нуклеотида на З'-концах. Именно такая структура необходима для участия в последую­щих этапах процесса, приводящего к сайленсингу РНК. Молекулы с тупыми концами или с модификацией в 5'-концевой области активностью siРНК не обладают.

Следующие стадии интерференции - распо­знавание и фрагментация РНК-мишени. siРНК связывается с группой белков, образуя многоком­понентный нуклеопротеиновый комплекс RISC (RNA-induced silencing complex-комплекс, осущест­вляющий индуцированное РНК подавление активности ге­на). В состав комплекса RISC входит белок семейства Argonaute - Аgо2, содержащий домены РАZ и PIWI.

Данные рентгеноструктурного анализа свидетель­ствуют о сходстве пространственных структур до­мена PIWI и РНКазы Н. Очевидно, именно домен PIWI обусловливает эндонуклеазную активность всего комплекса. Предполагают, что функция РАZ состоит в распознавании и связывании siРНК, имеющих два неспаренных нуклеотида на З'-конце. RISC, связанный с двухцепочечной siРНК, неактивен. Для его активации необходимо расхождение цепей siРНК, катализируемое АТР-зависимой хеликазой .

Показано, что активный RISC содержит толь­ко антисмысловую цепь siРНК, комплементар­ную участку мРНК-мишени, что позволяет ему распознавать и связываться с последователь­ностью-мишенью на мРНК, комплементарной этой цепи. После этого входящая в состав комплекса RISC эндорибонуклеаза рас­щепляет молекулу мРНК-мишени на фрагменты длиной от 21 до 23 н..

У растений и червей может происходить амп­лификация siРНК. За это отвечает РНК-зависи­мая РНК-полимераза (RdRp). Используя в качест­ве затравки антисмысловую цепь siРНК, а в каче­стве матрицы - молекулу мРНК, этот фермент синтезирует новые дцРНК, которые затем пре­вращаются в siРНК при участии Dicer. У этих организмов интер­ференции РНК имеет системный эффект, как следствие передачи сигнала из клетки в клетку или его доставки во все ткани организма. Такое явление называется системной супрессией. Пере­дача дцРНК или siРНК у растений может проис­ходить по цитоплазматическим мостикам из клетки в клетку или по системе сосудов.

Таким образом механизм интерференции РНК следующий: на первом этапе длинная дцРНК нарезается белком Dicer с образованием siРНК. Эта реакция протекает с использованием энергии АТР. Далее двухцепочечная siРНК связывается с группой белков, формируя нуклеопротеидный комплекс RISC (Этап 2). Один из его компонентов - АТР-зависимая хеликаза, которая раскручивает дуплекс siРНК. В результате в составе RISC остается только антисмысловая цепь siРНК (Этап 3). Такой модифицированный комплекс функционально активен. Активированный RISC распознает и связыва­ет мРНК-мишень за счет комплементарного спаривания с ней антисмысловой цепи siРНК (Этап 4). Далее входящий в состав комплекса белок Аgо2 разрезает молекулу мРНК (Этап 5). У растений и нематод существует механизм амп­лификации siРНК. При этом РНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует дцРНК на матрице мРНК, исполь­зуя в качестве затравки антисмысловую цепь siРНК (Дополнительный этап). Новосинтезированные дцРНК разреза­ются при участии Dicer, давая начало новому пулу siРНК [5].




Рис. 6. Механизм интерференции РНК (Цитировано по [5])

^ I.5. Структура РНК-содержащих стрессовых гранул

При некоторых видах стресса например, при тепловом шоке, воздействии УФ-офлучения, энергетическом голодании, окислитель­ном стрессе в цитоплазме клеток возникают стрессовые гранулы – плотные РНП-содержащие цитоплазматические тельца. В стрессовые гранулы при стрессе включается не вся клеточная мРНК: часть ее продолжает со­хранять диффузное распределение в цитоплазме. По-видимому, для инкорпорации мРНК в стрессовые гранулы не нужны какие-либо специ­фические сигнальные последовательности, по­скольку репортерная мРНК, не несущая извест­ных сигнальных последовательностей, включает­ся в состав стрессовых гранул. Скорее всего, специфические сигнальные последовательности
нужны для исключения РНК из стрессовых гра­нул. Возможно, что из стрессовых гранул выводятся как раз те РНК, трансляция ко­торых необходима при стрессе.

В составе стрессовых гранул выявлены раз­личные РНК-связывающие белки, связывающие как большинство цитоплазматических мРНК, так и специфические последовательности в опреде­ленных мРНК. К первой группе можно отнести РАВР (поли(А)-связывающий белок), FMRP, основной белок мРНП YВ-1. Белок Staufen, входящий в состав транспор­тирующихся мРНП, входит и в состав стрессовых гранул в олигодендроцитах, вероятно, как «неспе­цифический» РНК-связывающий белок. Ко второй группе относятся различные белки, специ­фически связывающие АU-богатые последова­тельности (АRE), содержащиеся в З'-концевой некодирующей области некоторых, обычно короткоживущих, мРНК. Из этой группы белков локализация в стрессовых гранулах была показа­на для тристетрапролина (ТТР), эндорибонуклеазы G3ВР, белков НuR, ВRF1, ТIА-1 и ТIAR.

Структурная основа стрессовых гранул не изучена, но весьма вероятно, что она состоит из прионоподобного конгломерата РНК-связывающего белка ТIА-1, обычно лока­лизованного в ядре.

Одной из первых адаптивных реакций при стрессовых воздействиях на эукариотическую клетку является изменение в системе трансляции. С одной стороны, происходит общее падение уровня синтеза белка в клетке, а с другой – акти­вация трансляции некоторых видов мРНК. Обра­зование стрессовых гранул происходит одновре­менно с общим снижением синтеза белка. В на­стоящий момент принято считать, что именно ингибирование синтеза белка на стадии инициации трансляции вызывает появление стрессовых гра­нул в цитоплазме. В случае окислительного стрес­са, вызванного арсенатом, образование стрессо­вых гранул зависит от ингибирования инициации трансляции за счет фосфорилирования фактора еIF2. Фосфорилирование α-субъединицы еIF2 по Sег-52 приводит к тому, что еIF2 прочно связы­вается с фактором еIF2В и блокирует замену GDР на GТР. В результате в клетке происходит резкое уменьшение количества активной формы факто­ра еIF2-GТР и, соответственно, снижение уровня тройственного комплекса (еIF2-тРНКМеt-GТР). В такой ситуации фор­мируются неканонические инициаторные ком­плексы, которые не могут перейти к элонгации трансляции.

Каков бы ни был механизм, запускающий об­разование стрессовых гранул, при стрессорном воздействии первоначально диффузное распреде­ление мРНП сменяется на локализацию в отдель­ных точках цитоплазмы – стрессовых гранулах. Для подобного изменения локализации необходи­мы значительные перемещения индивидуальных мРНП. При этом необходимо отметить, что раз­мер мРНП достаточно велик и свободная диффу­зия частиц подобного размера в цитоплазме огра­ничена. Преодоление ограничения диффузии в клетке происходит за счет активного транспор­та по цитоскелету – микротрубочкам или актиновым филаментам. Разрушение актиновых филаментов не ингибирует образова­ние стрессовых гранул, в отличие от нарушения системы микротрубочек. Вызванная действи­ем фармакологических агентов деполимеризация микротрубочек в клетке подавляет образование стрессовых гранул. Восстановление микротрубочек на фоне окислительного стресса вызывает возникновение в такой клетке стрессовых гранул. Скорее всего, роль микротрубочек в фор­мировании стрессовых гранул заключается в ак­тивном транспорте мРНП. Стрессовые гранулы способны перемещаться по клетке, и их движение подавляется при разрушении микротрубочек. Компоненты стрессовых гранул обмениваются с цитоплазмой, и этот обмен также значительно замедляется после разборки микротрубочек. Таким образом, микротрубочки необходимы для пространственного перемещения компонентов стрессовых гранул (поли(А)-связывающего белка, фактора eIF2, белка TIA-1).

Функции стрессовых гранул пока остаются непонятными. Можно пред­положить, что роль стрессовых гранул состоит в подавлении трансляции большинства матриц при избирательном отсутствии подавления трансля­ции определенных мРНК. Так, активно трансли­рующаяся при стрессе мРНК шаперона Нsp70 не включается в стрессовые гранулы. Синтез в клетках рекомбинантной укороченной формы белка ТIА-1, ингибирующей образование стрес­совых гранул, одновременно усиливает трансля­цию репортерной мРНК в клетках, подвергнутых стрессу. Стрессо­вые гранулы можно представить как «зал ожида­ния», в котором «пассажиры» - неполные инициаторные комплексы – терпеливо пережидают не­летную погоду [7].

^ I.6. Появление концепции «Мира РНК»

Действительно, РНК является уникальным биополимером, которому свойственны как функ­ции ДНК, так и белков. Ее уникальные свойства быть как носителем наследуемой информации, так и возможность образовывать сложные трехмерные структуры, обладающие каталитической активностью, определяют то, что первичной молекулой могла быть РНК. Таким образом, в одной молекуле заложены как генотип, так и фенотип. Ключевым ферментом такого мира должен быть фермент РНК-репликаза, сделанный из РНК. Спектр реакций, выполняемых ферментами РНК – рибозимами – очень широк, поэтому в последнее время ведутся очень активные поиски новых рибозимов, способных осуществлять другие типы реакций.

^ I.6.1. Рибозимы

Рибозимы — не совсем ферменты: по своей химической природе это не белки, а тоже молекулы РНК, только выполняющие специальные функции. Они служат катализаторами при расщеплении и сшивании других молекул РНК. У рибозимов есть интересная особенность: максимум их активности приходится на низкие температуры. То есть они фактически обеспечивают низкотемпературный катализ.

Первые рибозимы, обнаруженные Альтманом и Чеком в 1982-1983 гг, были не особенно эффективны: они лишь разрезали и соединяли отдельные фрагменты целых молекул РНК. Однако дальнейшие исследования продемонстрировали, что эти ферменты могут катализировать и другие реакции. Джек Шостак, экспериментируя с модифицированными рибозимами, сумел выделить катализатор, способный соединять друг с другом короткие цепочки нуклеотидов. При этом использовалась энергия трифосфатных химических групп – тех самых соединений, которые и сегодня обеспечивают энергией биохимические реакции. Это обстоятельство подтвердило идею, что рибозимы могут функционировать сходным образом с современными белковыми ферментами.

У ряда видов примитивных эукариот (Tetrahymena thermophila и др.) гены рРНК содержат особые интро­ны (интроны группы 1), для которых характерен уникальный ме­ханизм сплайсинга. Такие интроны встречаются также в генах рРНК митохондрий, хлоропластов, дрожжей и грибов, однако они не выявлены в генах позвоночных животных. Изучение процессинга 26S рРНК тетрахимены (аналог 28S рРНК высших эукариот), вы­полненное Чеком и сотрудниками, привело к открытию особо­го вида сплайсинга, осуществляемого без участия каких-либо бел­ков и получившего название аутосплайсинг (сплайсинг типа I).

Оказалось, что содержащаяся внутри 26S рРНК тетрахимены вставка (интрон) длиной 400 нуклеотидов способна сама осуще­ствлять вырезание этого интрона и сшивание экзонов в присут­ствии Мg2+ и свободного гуанозина (либо его фосфорилированных производных). Таким образом была открыта аутокаталитическая функция РНК и положено начало изучению рибозимов.

Аутосплайсинг индуцируется гуанозином, гидроксильная группа которого атакует фосфатную группу на 5'-конце интрона, в результате чего разрывается межнуклеотидная (фосфодиэфирная) связь и высвобождается З'-конец экзона 1. Затем гидроксильная группа, содержащаяся на З'-конце экзона 1, атакует фосфатную группу на З'-конце интрона, что ведет к вычленению интрона и замыканию фосфодиэфирной свя­зи между ОН-группой З'-конца экзона 1 и 5'-фосфатной группой экзона 2. Таким образом в результате реакции трансэтерификации без дополнительных затрат энергии осуществляется лигирование двух экзонов с образованием зрелой 26S рРНК. Вырезанный интрон затем циклизуется. Из его состава путем двухэтапного ауторасщепления освобождается фрагмент, содержащий 19 нуклеотидов, в результате чего образуется РНК длиной 376 нуклеотидов (L-19 IVS), которая и представляет собой истинный РНК-фер­мент (рибозим), обладающий каталитическими свойствами. Этот рибозим обладает устойчивой структурой, имеет эндонуклеазную

Рис. 7. Схема аутосплайсинга у тетрахимены и процесс образования рибозима (Цитировано по [1])


активность, расщепляя длинные одноцепочечные РНК. Оказалось также, что рибозим L-19 IVS помимо нуклеазной обладает in vitro нуклеотидилтрансферазной (полимеразной) активностью и способен катализировать синтез олигонуклеотидов (олиго-С). Это указывает на возможность аутокаталитической репликации РНК и является одним из важных сви­детельств в пользу существования «мира РНК». В структу­ре интронов типа I выявлены характерные внутренние олигопуриновые последовательности (у тетрахимены это последователь­ность GGАGGG), называемые адапторными последовательностя­ми, которые участвуют в образовании активного центра РНК-ферментов и выполняют важнейшую роль в каталитическом рас­щеплении РНК.

Детальные исследования природных РНК-ферментов послужили мощным стимулом к моделированию и синтезу рибозимов задан­ного строения. Эти работы позволили установить, что каталити­ческой активностью обладают не только крупные РНК (~ 400 нук­леотидов у тетрахимены), но и короткие 13 — 20-членные олигонуклеотиды, которые могут быть синтезированы in vitro. Такие рибозимы стали называть минизимами [1].


^ I.6.2. Возникновение древнего мира РНК

Именно открытие каталитически активных РНК – рибозимов привело к созданию концепции «мира РНК». Вскоре после открытия рибозимов Т. Чеком в одной из своих работ Ф. Крик писал: «Эти эксперименты (по каталитической РНК) поддержи­вают гипотезу, что биохимия РНК предшествовала традицион­ной биохимии, основанной на нуклеиновых кислотах и белках» [4].

А Белозерский в 1957 году писал: «Нет никаких сомнений, что в процессе разви­тия органического мира нуклеиновые кислоты играли значительную роль. Однако вряд ли на ранних этапах развития жизни возникли одновре­менно и РНК, и ДНК. Нам представляется, что возникновение рибонуклеотидов и затем РНК бы­ло первичным. ДНК возникла значительно позже и параллельно с усложнением функций и все боль­шей дифференциацией протоплазмы».

Теперь можно было предположить, что молеку­лы РНК могли бы обходиться не только без ДНК как генетического вещества, но и без белков для осуществления катализа важных синтетических и метаболических реакций. Идея древнего безбелкового мира РНК как возможного предшествен­ника современной жизни на Земле была оконча­тельно сформулирована в 1986 г. и быстро приобрела многочисленных сторонников. В на­стоящее время гипотеза о том, что жизнь начиналась с молекул РНК и их ансамблей, является обще­принятой. Таким образом, термин «мир РНК» широко используется теперь для обозначения древ­ней, пребиотической ситуации на Земле, имевшей место около 4 млрд. лет назад, когда самореплицирующиеся молекулы РНК или их ансамбли могли существовать и эволюционировать без белков.

Таким образом, согласно существующим пред­ставлениям, в древнем мире РНК не было ни бел­ков, ни ДНК, а лишь ансамбли различных молекул РНК, выполняющих разные вышеперечисленные функции. Однако вопрос о возникновении такого мира на Земле – один из самых трудных в науке о происхождении жизни. Можно предполагать, что первичные олигорибонуклеотиды возникали из абиогенно (вне организма без участия ферментов) образующихся монорибонуклеотидов или их активированных производных путем полимеризации на поверхностях глин и глиноподобных минералов. Возможно также, что был этап, предшествующий химической эволюции нуклеотидоподобных и олигонуклеотидоподобных соедине­ний. В любом случае, появление олигорибонуклеотидов должно было быть отправной точкой появления мира РНК. Однако для дальнейшего раз­вития было необходимо, чтобы абиогенный синтез олигорибонуклеотидов, основанный на редких слу­чайных событиях, был дополнен постоянным меха­низмом, который мог бы генерировать варианты этих олигомеров и удлинять их (при сильной тен­денции к их спонтанной химической и физической деструкции). Элонгация коротких олигорибонукле­отидов в полирибонуклеотиды представляется абсолютно необходимым условием для образования компактно свернутых структур со свойствами спе­цифического узнавания лигандов и каталитическими активностями, а генерация вариантов в популя­ции абиогенных олиго- и полирибонуклеотидов требуется для того, чтобы дать возможности для случайного возникновения нужных функциональ­ных, в том числе каталитических, активностей.

В течение долгого времени не было предложе­но сколько-нибудь удовлетворительного реше­ния этой проблемы. Около 10 лет назад А.Б. Четвериным и сотрудниками был разработан метод молекулярного клонирования РНК: из единич­ных молекул РНК, помещенных на поверхность геля, содержащего катализатор репликации (в данном случае вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу) и рибонуклеозидтрифосфаты, ока­залось возможным выращивать колонии молекул РНК, идентичных исходной молекуле. Позд­нее метод был применен для регистрации единич­ных событий, происходящих внутри популяции РНК в растворе, и была впервые эксперимен­тально показана способность молекул РНК к спонтанной перестройке их нуклеотидных после­довательностей в отсутствие каких-либо фермен­тов и рибозимов. Открытая спонтанная реак­ция характеризовалась следующими особеннос­тями. Во-первых, цепи РНК в растворе при температурах от 5 до 37°С время от времени об­мениваются частями своих последовательностей; обмен может происходить как между разными молекулами (транс-перестройки), так и внутри одной и той же молекулы (цис-перестройки). Во-вторых, эти перестройки не специфичны по отно­шению к последовательности и могут происхо­дить в любом месте цепей. В-третьих, в отличие от рибозимных и ферментативных реакций, а также реакций самокатализируемого сплайсинга, З'-гидроксилы не участвуют в этой спонтанной реакции, а молекулы или участки РНК реагиру­ют друг с другом внутренними районами. Реакция зависит от присутствия Мg2+. Скорость спонтан­ных перестроек невелика – одно событие в час на миллиард нуклеотидов; это означает, что 0.002-0.02% цепей РНК с длиной 800-8000 нуклеотидных остатков спонтанно перестраиваются в попу­ляции РНК в течение 24 ч. Реакция не требует ни­каких других компонентов, кроме самой РНК и Мg2+, и, таким образом, может рассматриваться как присущее РНК химическое свойство и должна происходить повсюду в живой и неживой природе.

Появление достаточно длинных полирибонуклеотидов и генерация вариантов за счет спонтанных цис- и транс-перестроек должны были привести к случайному появлению рибози­мов, и критическим этапом должно было стать возникновение в популяции РНК рибозима, ката­лизирующего процесс комплементарной репли­кации РНК. Это – принципиальное условие для того, чтобы размножить – амплифицировать – единичные молекулы случайно возникших в по­пуляции вариантов и сохранить их для эволюции. Другими словами, появление механизмов РНК-катализируемой репликации РНК должно рас­сматриваться как первое и необходимое условие для начала эволюции мира РНК. С появлением таких рибозимов – хотя бы одной молекулы на популяцию молекул РНК в каком-то небольшом водоеме – мир РНК обрел свою сущность как самосохраняющаяся и развивающаяся материя на древней Земле.

Возникновение и существование мира РНК на Земле, естественно, могло иметь место только в жидкой водной среде с нейтральным рН и раство­ренными солями одновалентных металлов (в пер­вую очередь К+ и Na+) и Мg²+. Скорее всего это были мелкие водоемы и лужи («Дарвиновские пруды»), где могли концентрироваться абиогенно возникающие органические вещества; оке­анские просторы вовсе не годились для этого. (Впрочем, как полагает большинство геологов и палеонтологов, в то время океаны на Земле, по-видимому, еще и не существовали.) Присутствие РНК-репликазной активности в водной среде РНК-содержащей лужи или пруда давало в резуль­тате эффект амплификации всех олиго- и полирибонуклсотидов этого водоема, т.е. рост общей по­пуляции молекул РНК. Однако на этом этапе еще не могло быть никакого отбора «лучших» и, стало быть, никакой биологической эволюции.

Дело в том, что в таком случае эффективный РНК-реплицирующий рибозим, присутствующий в луже, одинаково хорошо должен был амплифицировать как редкие молекулы РНК, обладаю­щие какими-либо полезными для популяции свойствами (например, свойством адсорбировать из среды различные субстраты или катализиро­вать синтез нужных веществ), так и основную массу неактивных, балластных молекул РНК. Чтобы естественный отбор начал работать, необ­ходима была какая-то форма компартментализации, обособления отдельных ансамблей РНК, в которых рибозимы и их продукты удерживались бы вместе. Только тогда естественный от­бор мог отличить те РНК, чей продукт лучше, и те ансамбли, чьи РНК функционально лучше до­полняют друг друга. Лучшие обособленные ан­самбли РНК – первозданные особи – должны рас­ти быстрее других, перерастать других, тем са­мым обеспечивая отбор лучших.

А.Б. Четвериным и сотрудниками экспериментально показана спо­собность молекул РНК формировать молекуляр­ные колонии на гелях или других влажных твер­дых средах, если на этих средах им предоставлены условия для репликации. Смешанные ко­лонии РНК на твердых или полутвердых поверх­ностях и могли быть первыми эволюционирую­щими бесклеточными ансамблями, где одни мо­лекулы выполняли генетические функции (репликацию молекул РНК всего ансамбля), а другие формировали структуры, необходимые для успешного существования (например, такие, которые адсорбировали нужные вещества из ок­ружающей среды) или были рибозимами, ответ­ственными за синтез и подготовку субстратов для синтеза РНК. Такая бесклеточная ситуация со­здавала условия для очень быстрой эволюции: ко­лонии РНК не были отгорожены от внешней сре­ды и могли легко обмениваться своими молекула­ми – своим генетическим материалом.

Эта альтернатива представляется наиболее ве­роятной потому, что образование колоний РНК легко себе представить в случае естественного подсыхания лужи, населенной молекулами РНК: на влажной поверхности глины, в тех местах, где оказывался РНК-реплицирующий рибозим, мо­лекулы РНК, осевшие на поверхность, должны были амплифицироваться и образовывать коло­А – при условии, что необходимые органичес­кие вещества (предшественники пуринов, пиримидинов, рибозы, и т.д.) и высокоэнергетические фосфаты присутствовали на той же поверхности. Таким путем могли образовываться смешанные колонии РНК с различными функциональными активностями. Такой ансамбль молекул РНК в виде смешанной колонии мог успешно существо­вать и расти, если он включал в себя лиганд-связывающие РНК для избирательной адсорбции и аккумуляции необходимых веществ из окружаю­щей среды, набор рибозимов, катализирующих метаболические реакции для синтеза нуклеотидов и их активированных (фосфорилированных) про­изводных, и рибозим, катализирующий ком­плементарную репликацию всех РНК колонии.

Наиболее серьезным следствием компартментализации РНК в форме смешанных колоний было появление механизма естественного отбора: колонии с РНК, более активными и более подхо­дящими друг другу (функционально дополняю­щими друг друга), могли расти быстрее и тем са­мым «перерастать» другие колонии, вытеснять их. Таким образом, образование компартментализованных ансамблей функционально дополняю­щих друг друга РНК в качестве особей, способных расти и конкурировать друг с другом, представля­ется вероятным, даже в отсутствие окружающих их мембран или оболочек другого типа, и даже без четкой границы раздела [2].

Заключение

Таким образом мог возникнуть «мир РНК», где РНК выступает как самодостаточная молекула, соче­тающая в себе генотип и фенотип одновременно и способная к эволюционному развитию благодаря рекомбинации и каталити­ческим способностям. Ключевым ферментом этого мира должен быть фермент РНК-репликаза, способный осуществлять аутокаталитическую репликацию РНК.

Существует несколько аргументов в пользу того, что РНК пред­ставляет собой первичную молекулу — носитель жизни. Известна способность РНК нести генетическую информацию. Это в полной мере свойственно ныне существующим РНК-содержащим виру­сам. Доказано также, что вирусные РНК способны к рекомбина­ции, в которую могут вовлекаться как вирусные, так и клеточные РНК. Широко известны ставшие уже классическими результаты опытов Г. Урея и С. Миллера, воспроизводящих первичную (аби­отическую) среду Земли. Так, из газообразных веществ (аммиака, углекислого газа, метана и водорода) при воздействии электри­ческого разряда и УФ-облучения можно получить элементарные соединения (формальдегид, синильную кислоту, мочевину, от­дельные аминокислоты и др.), из которых далее образуются пуриновые основания (А и G) — исходные молекулы, необходимые для образования нуклеотидов. Сами нуклеотиды уже являются убиквистическими молекулами, способными существовать в виде раз­личных жизненных форм (коферментов, энергоносителей и др.). В результате использования энергии, выделявшейся при нагрева­А сухих органических остатков или под действием каталитичес­кой активности неорганических полифосфатов, нуклеотиды мог­ли взаимодействовать друг с другом с образованием полимерных молекул. Случайное объединение нуклеотидов в полимерные цепи имело решающее значение, ибо привело к возникновению мат­ричных молекул, пригодных для комплементарного копирования. Дальнейшая эволюция этих молекул могла привести к отбору каталитически активных РНК.

В ходе дальнейшей биологической эволюции и особенно в свя­зи с возникновением клеточных форм жизни часть функций РНК, вероятно, перешла к ДНК, а другая часть — к белкам. Существу­ющие РНК обладают высоким разнообразием жизненных форм (фенотипов), превосходя в этом отношении ДНК, и сохраняют способность к хранению и передаче генетических признаков, чем принципиально отличаются от белковых молекул, многие из ко­торых они «приспособили» для обеспечения своего собственного существования.


Список литературы

  1. Коничев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология: Учеб. для студ. пед. вузов.- М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 400 с.

  2. Спирин А.С. Мир РНК и его эволюция // Молекулярная биология, 2005, том 39, № 4, с. 550-556.

  3. Спирин А.С. Биосинтез белков, мир РНК и происхождение жизни // Вестник РАН, 2001, № 4, с.320-328.

  4. Копылов А.М. Еще один шаг к «Миру РНК» // Биохимия, 1995, том 60, вып. 1, с. 159-161.

  5. Вильгельм А.Э., Чумаков С.П., Прасолов В.С. Интерференция РНК: биология и перспективы применения в биомедицине и биотехнологии // Молекулярная биология, 2006, том 40, №3, с. 387-403.

  6. Чуриков Н.А. Молекулярные механизмы эпигенетики // Биохимия, 2005, том 70, вып. 4, с. 493-513.

  7. Иванов П.А., Надеждина Е.С. Стрессовые гранулы: РНП-содержащие цитоплазматические тельца, возникающие в ответ на стресс. Состав и механизмы формирования // Молекулярная биология, 2006, том 40, № 6, с. 937-944.

  8. Зверева М.Э., Шпанченко О.В., Донцова О. А., Богданов А.А. Структура и функции тмРНК (10Sa РНК) // Молекулярная биология, 2000, том 34, № 6, с. 1081-1089.

  9. Рис Э. Стернберг М. От клеток к клеткам: Иллюстрированное введение в молекулярную биологию: Пер. с англ. - М.: Мир, 1988. – 144с.

  10. Кузнецов В.В. РНК-интерференция. Использование метода для создания нокаутных организмов и клеточных линий (обзор) // Биохимия, 2003, том 68.

  11. Darnell J., et.al. // Molecular Cell Biology. – N. Y.: Scientific Amer. Books, 1986. – P. 1052







Реклама:





Скачать файл (5405.5 kb.)

Поиск по сайту:  

© gendocs.ru
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации
Рейтинг@Mail.ru