Logo GenDocs.ru

Поиск по сайту:  


Загрузка...

Лабораторные работы по биохимии - файл Практикум.doc


Лабораторные работы по биохимии
скачать (47.4 kb.)

Доступные файлы (1):

Практикум.doc362kb.10.03.2005 08:24скачать

содержание
Загрузка...

Практикум.doc

1   2   3   4   5   6
Реклама MarketGid:
Загрузка...
^

ТЕМА 6. ХИМИЯ И ОБМЕН ЛИПИДОВ



Лабораторная работа № 8.

Определение содержания триацилглицеролов сыворотке крови ферментативным методом
Принцип метода: Метод определения триацилглицеролов (ТАГ) основан на реакции их гидролитического расщепления под действием фермента липазы. Высвободившийся глицерол далее ферментативно окисляется с образованием перекиси водорода. Перексид водорода реагирует с хромогеном под действием пероксидазы с образованием окрашеного хинонимина.

Липаза

Триацилглицеролы -------------- Глицерол + Жирные кислоты




ГК

Глицерол + АТФ ----------- Глицерол-3-фосфат + АДФ




ГФО

Глицерол-3-фосфат + О2 ----------- Дигидроксиацетонфосфат + Н2О2




ПО


Н2О2 + 4-аминоантипирин + трибромгидроксибензоат ----- Хинонимин + 2Н2О


Интенсивность образующейся окраски прямо пропорциональна содержанию триацилглицеролов в пробе.
^ Линейность метода: до 11,4 ммоль/л.

Норма: 0,6 – 2,3 ммоль/л.
Триацилглицеролы в негемолизированной сыворотке сохраняют стабильность при температуре хранения 2-8С в течение нескольких дней.
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 540 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 10 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови;

  5. Дистиллированная вода;

  6. Рабочий реагент (АТФ – 1 ммоль/л, 4-аминоантипирин – 0,4 ммоль/л, глицеролфосфатоксидаза (ГФО) –  2000 Е/л, липаза – 200 000 Е/л, глицеролкиназа (ГК) –  6000 Е/л, пероксидаза –  500 Е/л в буфере);

  7. Калибратор – калибровочный раствор триацилглицеролов, 2,28 ммоль/л.


^ Проведение анализа


Добавить в пробу:

Холостая проба

^ Калибровочная проба

Опытная проба

1. Калибратор

--

10 мкл

--

2. Сыворотка

--

--

10 мкл

3. Реагент

1 мл

1 мл

1 мл


Перемешать тщательно содержимое пробирок и инкубировать при температуре 37С в течение 5 минут или при комнатной температуре (18-25С) – в течение 15 минут. Измерить оптическую плотность опытной (Dоп) и калибровочной (Dкалиб) проб против холостой пробы при длине волны 540 нм. Окраска раствора стабильна в течение 30 минут.
Расчет
Содержание триацилглицеролов в сыворотке рассчитывают по стандарту (калибратор) по формуле:


Аоп

С (ммоль/л) = ------------  Скалиб,

Акалиб


где С – концентрация триацилглицеролов в анализируемой пробе, ммоль/л;

Аоп – оптическая плотность опытной пробы;

А
калиб – оптическая плотность калибровочной пробы;

Скалиб – концентрация триацилглицеролов в калибраторе, ммоль/л.

При содержании триацилглицеролов в пробе свыше 11,4 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.
Клинико-диагностическое значение: ТАГ определяют для типирования эссенциальных гиперлипопротеинемий. Например, гиперлипопротеинемия типа  отличается высоким уровнем холестерина в сыворотке по сравнению с типом , для которой характерно высокие уровни холестерина и ТАГ.

Повышение уровня ТАГ в сыворотке бывает и при других заболеваниях (переломы костей, нефротический синдром, гипотиреоз, алкоголизм), но диагностического значения в этих случаях не имеет.

Иногда, при несвоевременном заборе биоматериала, можно обнаружить алиментарную гипертриглицеридемию, характеризующуюся высокими концентрациями ТАГ после приема жирной пищи.


Лабораторная работа № 9.

Определение концентрации общего холестерола в сыворотке крови ферментативным методом


Принцип метода: Эфиры холестерола под действием фермента холестеролэстеразы распадаются на холестерол и жирные кислоты. Холестерол окисляется холестеролоксидазой с образованием перекиси водорода. Пероксид водорода реагирует с хромогеном с образованием окрашенного вещества (хинонимин):

Эстераза

Эфиры холестерола ----------------> Холестерол + Жирные кислоты




Оксидаза

Холестерол + О2 ----------------> Холест-4-ен-3-он + Н2О2




Пероксидаза


2О2 + ГБА + 4-Амноантипирин ------------------------> Хинонимин + 4Н2О



Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации холестерола в нем.
^ Линейность метода: до 19,4 ммоль/л.

Норма:

Сыворотка крови –  5,2 ммоль/л (37С).
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 10 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови;

  5. Реагент (холестеролэстераза, холестеролоксидаза  50 Е/л, пероксидаза  1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л);

  6. Стандарт (Холестерол 5,2 ммоль/л);

  7. Дистиллированная вода.


Проведение анализа


Добавить в кювету

Опытная проба

^ Холостая проба

Стандартная проба

1. Сыворотка

10 мкл

--

--

2. Стандарт

--

--

10 мкл

3. Дистиллиро-ванная вода

--

10 мкл

--

4. Реагент

1 мл

1 мл

1 мл


Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (А). Окраска стабильна в течение 30 минут.
Расчет
Расчет по стандарту концентрации холестерола в сыворотке проводят по формуле:


Аоп

С (ммоль/л) = -----------  Сст,

Аст

где Аоп / ст – оптическая плотность опытной пробы и стандартной,

соответственно;

Сст – концентрация стандарта (ммоль/л).
Если концентрация холестерола превышает 19,4 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.
Клинико-диагностическое значение: Уровни холестерола важны в диагностике и классификации гиперлипопротеинемий.

Концентрация холестерина в сыворотке указывает на работу печени, билиарного тракта, всасывание в кишечнике.

Высокие концентрации холестерина говорят об угрозе ишемической болезни сердца, о нарушении тиреоидной функции и заболеваниях надпочечников.
Лабораторная работа № 10.

Определение концентрации холестерина ЛПВП в сыворотке крови


Принцип метода: Холестерол липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) определяют после осаждения из сыворотки липопротеинов низкой и очень низкой плотности (ЛПНП и ЛПОНП, соответственно). Супернатант содержит холестерол, связанный с ЛПВП в растворенной форме и определяется ферментативным методом для определения концентрации общего холестерола.

Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации холестерола в ЛПВП.
^ Линейность метода: до 19,4 ммоль/л.

Норма:

Сыворотка крови –  0,9 ммоль/л (37С).
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 10 мкл, 400 мкл , 2 мл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови;

  5. Осаждающий реагент (хлорид магния, 100 ммоль/л в ортофосфорной кислоте, 30,3 ммоль/л)

  6. Реагент (холестеролэстераза, холестеролоксидаза  50 Е/л, пероксидаза  1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л);

  7. Стандарт (Холестерол 1,2 ммоль/л);

  8. Дистиллированная вода.


Проведение анализа
В пластиковую пробирку внести 400 мкл сыворотки и добавить 2 мл осаждающего реагента. Тщательно перемешать в течение 15 секунд. После чего центрифугировать 3000 об/мин в течение 5 минут. Отобрать 1мл супернатанта в чистую пробирку и использовать для последующего определения холестерола в ЛПВП.


^ Добавить в кювету

Опытная проба

Холостая проба

Стандартная проба

1. Супернатант

10 мкл

--

--

2. Стандарт

--

--

10 мкл

3. Дистиллиро-ванная вода

--

10 мкл

--

4. Реагент

1 мл

1 мл

1 мл


Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (А). Окраска стабильна в течение 30 минут.


Расчет
Расчет по стандарту концентрации холестерола в сыворотке проводят по формуле:


Аоп

С (ммоль/л) = -----------  Сст,

Аст

где Аоп / ст – оптическая плотность опытной пробы и стандартной,

соответственно;

Сст – концентрация стандарта (ммоль/л).


^ Общий холестерол сыворотки

Норма

Пограничные значения

Высокий уровень

 5,2 ммоль/л

5,2-6,1 ммоль/л

 6,2 ммоль/л

^ Холестерол ЛПВП

Норма

Пограничные значения

Низкий уровень

 0,9 ммоль/л

 0,9 ммоль/л;

 0,9 ммоль/л

 0,9 ммоль/л


Клинико-диагностическое значение: Содержание холестерола в ЛПВП в кови здоровых людей мало меняется с возрастом и не подвержено колебаниям.

Величины содержания холестерола в ЛПВП  0,9 ммоль/л свидетельствуют о нарушении липидного обмена и угрозе атеросклероза. Повышение содержания холестерола в ЛПВП, как и повышение содержания общего холестерина в результате увеличения этой фракции, является доброкачественным состоянием.
^

ТЕМА 7. БЕЛКОВЫЙ ОБМЕН



Лабораторная работа № 11.

Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови кинетическим методом


Принцип метода: Аланинаминотрансфераза (АЛТ) катализирует обратимое трансаминирование L-аланина в L-глутамат с образованием пировиноградной кислоты. Далее пировиноградная кислота под действием лактатдегидрогеназы (ЛДГ) восстанавливается до D-лактата с одновременным окислением НАДН до НАД+.


АЛТ

L-Аланин + -кетоглутарат ----------- L-глутамат + Пируват




ЛДГ

Пируват + НАДН + Н+ ----------- D-Лактат + НАД+






Кинетическое спектрофотометрическое определение активности АЛТ основано на регистрации падения оптической плотности анализируемой пробы при длине волны 340 нм. Скорость снижения оптической плотности пробы при длине волны 340 нм прямо пропорциональна активности АЛТ в ней.
^ Линейность метода: 4-280 Е/л.

Норма: мужчины –  41 Е/л (37С);

женщины –  31 Е/л (37С).
АЛТ в сыворотке сохраняет стабильность при комнатной температуре (18-25С) в течение 24 часов, при замораживании (-20С) в течение 3 месяцев.
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 340 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 100 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови / гепаринизированная или ЭДТА плазма;

  5. Реагент 1 (L-аланин 500 ммоль/л, ЛДГ  1200 Е/л в ТРИС-буфере (рН 7,50,1) – 100 ммоль/л);

  6. Реагент 2 (-кетоглутарат 15 ммоль/л, НАДН 0,18 ммоль/л);

  7. Монореагент (смешать 4 части реактива 1 с одной частью реактива 2).

Монореагент годен для применения при условии хранения его в темноте при температуре 2-8С в течение 4 недель.

^ Проведение анализа

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37С).

^ Добавить в кювету

Опытная проба

1. Сыворотка

100 мкл

2. Монореагент

1 мл

Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Измерить оптическую плотность пробы против воздуха при длине 340 нм ровно через 1 минуту. Повторить измерение 3 раза с интервалом 1 мин. Рассчитать изменение оптической плотности за каждую минуту а затем вычислить среднее измерение оптической плотности в минуту (о.п./мин).

Расчет

Расчет по фактору активности АЛТ проводят по формуле:

о.п./мин  1,100  1000

ААЛТ (Е/л) = ----------------------------------- = о.п./мин  1745,

6,30  0,100  1,0

где о.п./мин – среднее изменение оптической плотности в минуту;

1,100 – общий объем раствора в кювете в мл;

1000 – коэффициент перевода мл в л;

6,30 – коэффициент миллимолярного поглощения НАДН;

0,100 – объем сыворотки в мл;

1,0 – длина оптического пути.

Значение фактора для расчета активности АЛТ можно взять из таблицы:

^ Длина волны

Температура реакции

25-30С

Температура реакции 37С

340 нм

952

1745

334 нм

971

1780

365 нм

1765

3235


При внесении каких-либо изменений в перечисленные параметры фактор следует пересчитать.

Если активность АЛТ превышает 280 Е/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:9 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 10.
Клинико-диагностическое значение: АЛТ в высоких концентрациях присутствует в клетках печени и в меньшей степени в скелетных мышцах, почках и сердце.

Наиболее часто повышение активности АЛТ в сыворотке отмечается при острых заболеваниях печени и желчных путей. У больных острыми вирусными гепатитами активность фермента резко повышается в ранние сроки болезни, обычно за 5-2 дня до появления желтухи. Пик активности АЛТ приходится на момент появления желтухи и нормализуется к исходу 8-й недели болезни. Длительное незначительное увеличение активности АЛТ в сыворотке часто свидетельствует о хроническом процессе заболевания (хронический гепатит, цирроз.

Лабораторная работа № 12.

Определение активности аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови кинетическим методом


Принцип метода: Аспартатаминотрансфераза (АСТ) катализирует обратимое трансаминирование L-аспартата в L-глутамат с образованием щавелевоуксусной кислоты. Далее щавелевоуксусная кислота под действием малатдегидрогеназы (МДГ) восстанавливается до малата с одновременным окислением НАДН до НАД+.


АСТ

L-Аспартат + -кетоглутарат ----------- L-глутамат + Оксалоацетат




МДГ

Оксалоацетат + НАДН + Н+ ----------- Малат + НАД+






Кинетическое спектрофотометрическое определение активности АСТ основано на регистрации уменьшения оптической плотности анализируемой пробы при длине волны 340 нм. Скорость снижения оптической плотности пробы при длине волны 340 нм прямо пропорциональна активности АСТ в ней.
^ Линейность метода: до 300 Е/л.

Норма: 8-40 Е/л (37С);
АСТ в сыворотке сохраняет стабильность при комнатной температуре (18-25С) в течение 4 дней, при замораживании (-20С) в течение 14 дней.
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 340 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 100 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови негемолизированная;

  5. Реагент (-кетоглутарат 12 ммоль/л, L-аспартат 200 ммоль/л, НАДН 0,2 ммоль/л, МДГ  600 Е/л в ТРИС-буфере (рН 7,80,1),100 ммоль/л);

  6. Дистиллированная вода.

Реагент годен для применения при условии хранения его при температуре 2-8С в течение 10 дней.

^ Проведение анализа

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37С).


^ Добавить в кювету

Опытная проба

1. Сыворотка

100 мкл

2. Реагент

1 мл


Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Измерить оптическую плотность пробы против дистиллированной воды при длине 340 нм ровно через 1 минуту. Повторить измерение 3 раза с интервалом 1 мин. Рассчитать изменение оптической плотности за каждую минуту а затем вычислить среднее измерение оптической плотности в минуту (о.п./мин).
Расчет

Расчет по фактору активности АСТ проводят по формуле:

о.п./мин  1,1  1000

ААСТ (Е/л) = ----------------------------------- = о.п./мин  1768,

6,22  0,1  1,0

где о.п./мин – среднее изменение оптической плотности в минуту;

1,1 – общий объем раствора в кювете в мл;

1000 – коэффициент перевода мл в л;

6,22 – коэффициент миллимолярного поглощения НАДН;

0,1 – объем сыворотки в мл;

1,0 – длина оптического пути.
При внесении каких-либо изменений в перечисленные параметры фактор следует пересчитать.

Если активность АСТ превышает 300 Е/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение: АСТ в высоких концентрациях присутствует в клетках сердечной мышцы, печени, почках и эритроцитах. Поражение любого из этих органов и тканей может привести к значительному повышению активности АСТ в сыворотке.

Наиболее резкие изменения в каталитической концентрации АСТ наблюдаются при поражении сердечной мышцы. При остром инфаркте миокарда увеличение активности АСТ обычно начинается через 6-12 часов после возникновения боли, достигает максимума через 24-48 часов, а затем постепенно падает, возвращаясь в норму через 4-5 дней с начала приступа. Если в течение нескольких дней нормализации активности фермента не происходит, то это свидетельствует о расширении зоны инфаркта и является плохим прогностическим признаком.

Умеренное повышение активности АСТ в сыворотке характерно для хронических и инфильтративных болезней печени (цирроз, механическая желтуха, метастазы опухоли в печени), а также при поражении скелетной мускулатуры (прогрессирующая мышечная дистрофия, разможжение мышц, травма).
^
Коэффициент Де Ритиса

Коэффициент Де Ритиса – это отношение активностей АСТ/АЛТ. В норме он равен 0,6-0,8.

При вирусных гепатитах его значения варьируют в пределах 0,2-0,5. В разгар болезни коэффициент Де Ритиса может вырасти до 1,0 (активности АСТ и АЛТ очень высоки) и выше – это плохой прогностический признак, свидетельствующий о наступлении дистрофии печени.

Значение коэффициента Де Ритиса при обтурационных желтухах, циррозах и хронических заболеваниях печени, как правило, > 1, при этом наблюдается незначительное повышение активности ферментов АСТ и АЛТ.

Лабораторная работа № 13.

Определение концентрации мочевины в сыворотке крови ферментативным методом


Принцип метода: Мочевина под действием фермента уреазы распадается на углекислый газ и аммиак. Аммиак реагирует с хромогеном (фенол-гипохлорит) в присутствии акселератора реакции нитропруссида натрия с образованием синего красителя:

Уреаза


Мочевина + Н2О ----------------> 2 Н3+ СО2

Нитропруссид


Н3 + Фенол-гипохлорит ------------------------> Индофенол



Интенсивность окраски раствора при длине волны 500-650 нм прямо пропорциональна концентрации мочевины в нем.
^ Линейность метода: до 26,8 ммоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – 2,5-6,4 ммоль/л (37С).
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 500-650 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 10 мкл, 2,5 мл;

  4. Сыворотка крови;

  5. Реагент (фенол-гипохлорит, нитропруссид натрия, уреаза в буфере, рН 6,5 );

  6. Стандарт (раствор мочевины 10,6 ммоль/л);

  7. Дистиллированная вода.


Проведение анализа


Добавить в кювету

Опытная проба

^ Холостая проба

Стандартная проба

1. Сыворотка

10 мкл

--

--

2. Стандарт

--

--

10 мкл

3. Дистиллиро-ванная вода

--

10 мкл

--

4. Реагент

1 мл

1 мл

1 мл


Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 20 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 500-650 нм.
Расчет
Расчет по стандарту концентрации мочевины в сыворотке крови проводят по формуле:


Аоп

С (ммоль/л) = -----------  Сст,

Аст


где Аоп / ст – оптическая плотность опытной и стандартной проб,

соответственно;

Сст – концентрация стандарта (ммоль/л).
Если концентрация мочевины превышает 26,8 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.
Клинико-диагностическое значение: Отклонения от нормы содержания мочевины в сыворотке крови зависят от скорости ее биосинтеза и выделения.

Увеличение концентрации мочевины в сыворотке крови – один из главных признаков нарушения функции почек. Из фракций остаточного азота раньше всего повышается уровень мочевины и может достигать 90% от всего остаточного азота.

Повышение концентрации мочевины в сыворотке крови может носить и внепочечный характер: при потере жидкости организмом, при усиленном распаде белков (острая желтая атрофия печени, тяжелые заболевания).

Уменьшение содержания мочевины в сыворотке крови наблюдается при заболеваниях печени (паренхиматозная желтуха, цирроз) по причине нарушенного синтеза мочевины в гепатоцитах.

Лабораторная работа № 14.

Определение концентрации креатинина в биологических жидкостях кинетическим методом


Принцип метода: Кинетический метод без депротеинирования (осаждения белка) основан на цветной реакции Яффе (Jaffe). Креатинин в щелочной среде образует с пикриновой кислотой окрашенный (оранжевый) комплекс.

Изменение оптической плотности пробы за фиксированное время при длине волны 490-510 нм прямо пропорционально концентрации креатинина в ней.
^ Линейность метода: до 1,33 ммоль/л.
Норма:

Сыворотка крови – мужчины – 53-97 мкмоль/л (25-37С);

женщины – 44-80 мкмоль/л (25-37С).

Суточная моча – 88,5-133 ммоль/л.
Концентрация креатинина сохраняется стабильной в образцах при температуре хранения 2-8С в течение 24 часов.

Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 490-510 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 50 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови/ суточная моча. Мочу предварительно развести деионизированной водой в соотношении 1:50. Кроме сыворотки можно использовать гепаринизированную плазму;

  5. Реагент 1 (гидроксид натрия 160 ммоль/л);

  6. Реагент 2 ( пикриновая кислота 4,0 ммоль/л);

  7. Стандарт (раствор креатинина 177 мкмоль/л);

  8. Дистиллированная вода.


Проведение анализа


^ Добавить в кювету

Опытная проба

Холостая проба

Стандартная проба

1. Образец (например, сыворотка)

50 мкл

--

--

2. Стандарт

--

--

50 мкл

3. Дистиллирован-ная вода

--

50 мкл

--

4. Реагент 1.

1 мл

1 мл

1 мл

Перемешать содержимое пробирок

5. Реагент 2

250 мкл

250 мкл

250 мкл


Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Точно через 60 секунд измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 490-510 нм (А1). Повторить измерение через 60 секунд (А2). Рассчитать изменение оптической плотности за минуту для опытной и стандартной проб:

Аоп = А2оп – А1оп;

Аст = А2ст – А1ст.
Расчет
Расчет по стандарту концентрации креатинина в сыворотке (плазме) проводят по формуле:


Аоп

С (мкмоль/л) = -----------  Сст,

Аст


где Аоп / ст – изменение оптической плотности в минуту;

Сст – концентрация стандарта.
Расчет по стандарту концентрации креатинина в суточной моче проводят по формуле:


Аоп

С (ммоль/л) = -----------  Сст  50,

Аст


где Аоп / ст – изменение оптической плотности в минуту;

Сст – концентрация стандарта;

50 – коэффициент разведения.
Если концентрация креатинина превышает 1,33 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Нельзя анализировать иктеричные образцы, так как билирубин искажает результаты измерений.
Клинико-диагностическое значение: Определение концентрации креатинина проводят для исследования функции почек. При значительном ухудшении функции почек концентрация креатинина в сыворотке увеличивается.

У здоровых людей концентрация креатинина в сыворотке относительно постоянна и мало зависит от пола, возраста, диеты, так как образование креатинина в мышцах как конечного продукта метаболизма относительно постоянно.

Клиренс эндогенного креатинина используют в качестве меры клубочковой фильтрации.
^

ТЕМА 8. ОБМЕН СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ



Лабораторная работа № 15.

Определение концентрации мочевой кислоты в биологических жидкостях ферментативным методом


Принцип метода: Мочевая кислота под действием фермента уриказы окисляется до алантоина с образованием перекиси водорода. Пероксид водорода реагирует с хромогеном (4-аминоантипирин с N-этил-N-(гидрокси-3-сульфопропил)-m-толуидином [TOOS]) с образованием сине-фиолетового красителя:

Уриказа


Мочевая кислота + Н2О + О2 ----------------> Алантоин + СО2 = Н2О2

Пероксидаза


2О2 + ТООS + 4-Амноантипирин ------------------------> Индамин + 3Н2О



Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации мочевой кислоты в нем.
^ Линейность метода: 65,7 -1190 мкмоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – мужчины – 214-488 мкмоль/л (25-37С);

женщины – 137-363 мкмоль/л (25-37С).
Концентрация мочевой кислоты сохраняется стабильной в сыворотке/ плазме в течение 3 дней при комнатной температуре, при температуре хранения 2-8С – в течение 7 дней, при температуре –20С – в течение 6 месяцев.

Стабильность концентрации мочевой кислоты в моче – 4 дня при комнатной температуре.
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 20 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови/ гепаринизированная или ЭДТА- плазма / моча. Мочу предварительно развести дистиллированной водой в соотношении 1:10;

  5. Реагент 1 (ТООS 1 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);

  6. Реагент 2 (уриказа  50 Е/л, пероксидаза  1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);

  7. Стандарт (раствор мочевой кислоты 357 мкмоль/л);

  8. Дистиллированная вода.


Проведение анализа


^ Добавить в кювету

Опытная проба

Холостая проба

Стандартная проба

1. Образец (например, сыворотка)

20 мкл

--

--

2. Стандарт

--

--

20 мкл

3. Дистиллиро-ванная вода

--

20 мкл

--

4. Реагент 1.

1 мл

1 мл

1 мл

Перемешать содержимое пробирок, инкубировать 5 мин

5. Реагент 2

250 мкл

250 мкл

250 мкл


Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре или 5 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (оптическая плотность А). Окраска стабильна в течение 30 минут.
Расчет

Расчет по стандарту концентрации мочевой кислоты в биологической жидкости проводят по формуле:

Аоп

С (мкмоль/л) = -----------  Сст,

Аст

где Аоп / ст – оптическая плотность опытной и стандартной проб, соответственно;

Сст – концентрация стандарта (мкмоль/л).

Расчет по стандарту концентрации мочевой кислоты в моче проводят по формуле:

Аоп

С (ммоль/л) = -----------  Сст  11,

Аст

где Аоп / ст – оптическая плотность опытной и стандартной проб, соответственно;

Сст – концентрация стандарта (мкмоль/л);

11 – коэффициент разведения.

Если концентрация мочевой кислоты превышает 1190 мкмоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение: Мочевая кислота и ее соли являются конечными продуктами пуринового обмена.

При подагре, наиболее общем осложнении гиперурикемии, повышенный уровень мочевой кислоты в сыворотке крови ведет к образованию вокруг суставов кристаллов моноуреата натрия. Гиперурикемия наблюдается также при заболеваниях почек с пониженной экскрецией отходов жизнедеятельности, при голодании, употреблении наркотиков, избыточном потреблении алкоголя, а также при приеме некоторых лекарств. Гиперурикемия – составная часть непрямого фактора риска коронарной болезни сердца.

Гипоурикемия наблюдается редко и связана с редкими наследственными нарушениями метаболизма.
Лабораторная работа № 16.

Определение концентрации общего билирубина в сыворотке крови


Принцип метода: В кислой среде в присутствии диазотированного 2,4-дихлоранилина билирубин образует азосоединение красного цвета. Специфическая смесь детергентов делает возможным надежное и точное определение общего билирубина.

Интенсивность окраски раствора при длине волны 540-560 нм прямо пропорциональна концентрации билирубина в нем.
^ Линейность метода: 1,7 - 513 мкмоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – 1,7-21 мкмоль/л (25-37С).
Концентрация общего билирубина сохраняется стабильной, при условии непопадании солнечного света на образцы, в сыворотке/ гепаринизированной или ЭДТА-плазме в течение 1 дня при комнатной температуре, при температуре хранения 2-8С – в течение 7 дней, при температуре –20С – в течение 3 месяцев.
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 540-560 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 25 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови/ гепаринизированная или ЭДТА-плазма;

  5. Реагент 1 (детергент в ТРИС-буфере, рН 8,2 8 ммоль/л);

  6. Реагент 2 (соляная кислота 30 ммоль/л, 2,4-дихлорфенол 1 ммоль/л, детергент, диазониевая соль);

  7. Стандарт (раствор билирубина, 100 мкмоль/л);

  8. Дистиллированная вода.


Проведение анализа


^ Добавить в кювету

Опытная проба

Холостая проба

Стандартная проба

1. Образец (например, сыворотка)

25 мкл

--

--

2. Стандарт

--

--

25 мкл

3. Дистиллиро-ванная вода

--

25 мкл

--

4. Реагент 1.

1 мл

1 мл

1 мл

Перемешать содержимое пробирок, инкубировать 5 мин при 37С, или 10 мин при 20-25С. Измерить оптическую плотность А1 против холостой пробы при длине волны 540-560 нм.

5. Реагент 2

250 мкл

250 мкл

250 мкл


Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре или 5 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность А2 опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 540-560 нм. Вычислить А = А2 – А1 для образца и стандарта.
Расчет
Расчет по стандарту концентрации общего билирубина в сыворотке крови проводят по формуле:

Аоп

С (мкмоль/л) = -----------  Сст,

Аст

где А – разность оптических плотностей А1 и А2;

Сст – концентрация стандарта (мкмоль/л).
Если концентрация общего билирубина превышает 513 мкмоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.
Клинико-диагностическое значение: Билирубин – это продукт распада гемоглобина. Свободный (неконъюгированный) билирубин совершенно неполярен и почти нерастворим в воде, поэтому для транспортирования его в крови от селезенки к печени образуется комплекс с альбумином. В печени билирубин конъюгирует с глюкуроновой кислотой, а образующийся комплекс билирубин–глюкуроновая кислота (связанный билирубин) экскретируется в желчные протоки.

Гипербилирубинемия может бить вызвана увеличенным образованием свободного билирубина в результате гемолиза (гемолитическая/ прегепатитная желтуха), повреждения паренхимы печени (паренхиматозная/ интрагепатитная желтуха) или закупорки желчных протоков (обтурационная/ постгепатитная желтуха).

Хроническая врожденная гипербилирубинемия (преобладание свободного билирубина) называется синдромом Гилберта и встречается довольно часто.

Высокие уровни билирубина наблюдаются у 60-70% новорожденных из-за усиленного послеродового разрушения эритроцитов и отставания в активности ферментов деградации билирубина.

Общепринятые методы анализа определяют либо общий, либо прямой билирубин. Прямой билирубин – это конъюгированный, растворимый в воде билирубин. Следовательно, неконъюгированный (свободный) билирубин может быть оценен как разница между общим и прямым билирубином.


^

ТЕМА 9. БИОХИМИЯ КРОВИ И МОЧИ



Лабораторная работа № 17.

Определение концентрации альбумина в сыворотке крови по реакции с бромкрезоловым зеленым


Принцип метода: Метод основан на образовании окрашенных комплексных соединений при взаимодействии альбумина с бромкрезоловым знленым в слабокислой среде в присутствии детергента.

Интенсивность окраски пробы при длине волны 630 нм прямо пропорциональна концентрации альбумина в ней.
^ Линейность метода: 20-60 г/л.

Норма: 35-50 г/л. (18-25С);
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 630 (590-640) нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 18-25С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 5мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови/ плазма негемолизированные;

  5. Рабочий реагент (бромкрезоловый зеленый 74 мг, детергент Тритон Х-100 в ацетатном буфере);

  6. Стандарт (раствор альбумина 40 г/л);

  7. Дистиллированная вода.


Проведение анализа


Добавить в кювету

Опытная проба

^ Холостая проба

Стандартная проба

1. Сыворотка

5 мкл

--

--

2. Стандарт

--

--

5 мкл

3. Дистиллиро-ванная вода

--

5 мкл

--

4. Рабочий реагент

1 мл

1 мл

1 мл


Перемешать тщательно в течение 15 секунд содержимое пробирок, избегая образования пены. Инкубировать при комнатной температуре 10 минут. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 630 (590-640) нм. Окраска стабильна в течение 8 часов.

Расчет
Расчет по стандарту концентрации альбумина в сыворотке (плазме) проводят по формуле:


Аоп

С (г/л) = -----------  Сст,

Аст
1   2   3   4   5   6



Скачать файл (47.4 kb.)

Поиск по сайту:  

© gendocs.ru
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации
Рейтинг@Mail.ru