Logo GenDocs.ru

Поиск по сайту:  


Загрузка...

Лабораторные работы по биохимии - файл Практикум.doc


Лабораторные работы по биохимии
скачать (47.4 kb.)

Доступные файлы (1):

Практикум.doc362kb.10.03.2005 08:24скачать

содержание
Загрузка...

Практикум.doc

1   2   3   4   5   6
Реклама MarketGid:
Загрузка...
^

ТЕМА 10. ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА



Лабораторная работа № 20.

Определение лютеинизирующего гормона в моче с помощью экспресс-теста


Принцип метода: Экспресс-тест L-CHECK-1 представляет собой быстрый одностадийный тест для качественного определения лютеинизирующего гормона (ЛГ) в моче для предсказания точного дня овуляции. Полоска содержит две зоны: тестовую и контрольную. В основе метода лежит комбинация моноклонального окрашивающего коньюгата (коллоидное золото) и поликлональных, адсорбированных на твердой фазе антител к ЛГ человека. При прохождении исследуемого образца через тестовую зону полоски конъюгат связывается с ЛГ с образованием комплекса антиген-антитело. Этот комплекс взаимодействует с антителами к ЛГ. В случае всплеска концентрации ЛГ полоска приобретает малиновое окрашивание. Если концентрация ЛГ низкая, то в тестовой зоне появляется слабо розовое окрашивание или вообще отсутствие окраски. Это позволяет четко дифференцировать базальную концентрацию гормона от всплеска концентрации его, предшествующего овуляции. Малиновая окраска в контрольной зоне полоски (взаимодействие несвязанного коньюгата с реагентом) указывает на правильное проведение теста.
^ Чувствительность метода: 10 мМЕ/мл.

В некоторых случаях содержание ЛГ в образце ниже этого уровня дает слабоположительный результат (слабое розовое окрашивание).

Норма: Базальный уровень ЛГ в моче составляет 5-20 мМЕ/мл. У большинства женщин перед овуляцией уровень ЛГ в моче возрастает до 40мМЕ/мл и более.
Оборудование и реагенты:

  1. Емкость для взятия образцов мочи;

  2. Секундомер;

  3. Набор полосок в пластиковой трубке с влагопоглотителем;

  4. Дневная моча (содержит наибольшее количество ЛГ).


Проведение анализа


  1. Для эффективности проводимого теста необходимо установить среднюю продолжительность репродуктивного цикла (подсчет должен проводится как минимум в течение 2-х месяцев). Первый день менструации считается как первый день цикла:



^ Продолжитель-ность цикла, дни

День тестирования

Продолжитель-ность цикла, дни

День тестирования

21-22

6-й

32

15-й

23-24

7-й

33

16-й

25

8-й

34

17-й

26

9-й

35

18-й

27

10-й

36

19-й

28

11-й

37

20-й

29

12-й

38

21-й

30

13-й

39

22-й

31

14-й

40

23-й




  1. Погрузить полоску до красной метки в исследуемый образец мочи. Подержать ее там 5 секунд.

  2. Произвести учет результата через 5-10 минут.


^ Учет результатов


Отрицательный результат

Появление окрашенной малиновой полосы в контрольной зоне полоски при отсутствии или наличии слабого окрашивания в тестовой зоне указывает на нормальный базальный уровень ЛГ. Овуляция в ближайшие 40 часов не произойдет.

^ Положительный результат

Появление малиновой окраски одновременно в контрольной и тестовой зонах полоски. Овуляция должна наступить в течение ближайших 40 часов.

^ Неопределенный результат

Отсутствие выраженной розовой окраски в контрольной зоне полоски. Тест нельзя интерпретировать. Рекомендуется повторить исследование.


Результат должен интерпретироваться как положительный при наличии отчетливого окрашивания в тестовой зоне полоски, вне зависимости от его интенсивности. Обычно интенсивность окраски тестовой зоны значительно ниже интенсивности окраски контрольной зоны полоски.
Клинико-диагностическое значение: ЛГ представляет собой гликопротеин, синтезируемый передней долей гипофиза. Продукция ЛГ регулируется гипоталамусом, клетки которого секретируют лютропин-рилизинг-гормон.

У женщин ЛГ совместно с фолликулостимулирующим гормоном управляют репродуктивным циклом. Всплеск синтеза и секреции ЛГ наблюдается за 12-18 часов до овуляции.

У мужчин ЛГ стимулирует интерстициальные клетки семенников, которые продуцируют тестостерон.

Некоторые заболевания (киста яичника, эндокринные нарушения) могут оказывать влияние на результаты теста. Поэтому результаты тестирования должны рассматриваться только в совокупности с другими клиническими данными.

Тестирование нельзя проводить во время беременности, после начала менопаузы и при введении хорионического гонадотропина.


^ ТЕМА 11. БИОХИМИЯ СЛЮНЫ

Лабораторная работа № 21.

Определение активности -амилазы в сыворотке крови кинетическим методом


Принцип метода: В качестве субстрата для -амилазы используется мальтотриозид, связанный с хромогеном 2-хлор-п-нитрофенолом. Под действием -амилазы субстрат гидролизуется с выделением окрашенного 2-хлор-п-нитрофенола, мальтотриозы и глюкозы. Реакция протекает быстро и не требует присутствия в реакционной смеси коферментов. Скорость гидролиза субстрата прямо пропорциональна активности -амилазы в пробе и изеряется спектрофотометрически при длине волны 405 нм.


Субстрат-ХНФ ----------- ХНФ + глюкоза + Мальтотриоза



^ Линейность метода: до 1500 Е/л.

Норма: 25-125 Е/л (37С).

-Амилаза в негемолизированной сыворотке сохраняет стабильность при комнатной температуре (18-25С) в течение 7 дней, при температуре хранения 2-8С в течение 2 месяцев.
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 405 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 25 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови.

В качестве источника фермента можно использовать и слюнную жидкость (слюну предварительно разбавить дистиллированной водой в 100 раз), но диапазон нормы при этом варьирует в значительной степени.

  1. Дистиллированная вода;

  2. Рабочий реагент (субстрат – 1,8 ммоль/л в МЕS-буфере (рН 6,00,1)).

Рабочий реагент годен для применения, если его оптическая плотность не выше 0,6 ед.опт.плотн. при длине волны 405 нм и нет мутности.
^ Проведение анализа
Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37С).


^ Добавить в кювету

Опытная проба

1. Сыворотка

25 мкл

2. Рабочий реагент

1 мл


Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Измерить оптическую плотность пробы против дистиллированной воды при длине 405 нм ровно через 1 мин. Повторить измерение 3 раза с интервалом 1 мин. Рассчитать изменение оптической плотности за каждую минуту, а затем вычислить среднее измерение оптической плотности в минуту (о.п./мин).
Расчет
Расчет активности -амилазы по фактору проводят по формуле:


о.п./мин  1,025  1000

А-амилаза (Е/л) = ----------------------------------- = о.п./мин  3178,

12,9  0,025  1,0


где о.п./мин – среднее изменение оптической плотности в минуту;

1,025 – общий объем раствора в кювете;

1000 – коэффициент перевода мл в л;

12,9 – коэффициент миллимолярного поглощения 2-хлор-п-нитрофенола;

0,025 – объем сыворотки в мл;

1,0 – длина оптического пути.
При внесении каких-либо изменений в перечисленные параметры фактор следует пересчитать. Если активность -амилазы превышает 1500 Е/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.
Клинико-диагностическое значение: -Амилаза – это эндогидролаза и в организме человека представлена несколькими изоферментами: фермент секретируется слюнными железами (S-тип), поджелудочной железой (Р-тип); небольшая активность фермента обнаружена в печени, скелетных мышцах, слезной жидкости, секрете молочных желез и различных опухолях.

Активность -амилазы в сыворотке значительно возрастает за счет Р-изофермента при различных заболеваниях поджелудочной железы (панкреатит, абсцесс, травма, рак).

При повреждениях слюнных желез (рак слюнных желез, эндемический паротит, макроамилаземия) активность -амилазы в сыворотке также увеличивается, но за счет S-изофермента.

Оба изофермента -амилазы имеют небольшую молекулярную массу (45 000), поэтому фильтруются в почках и экскретируются с мочой. Повышение активности амилазы мочи (диастаза) при остром панкреатите наступает на 6-10 часов позднее, чем в сыворотке крови.
^ ТЕМА 12. БИОХИМИЯ КОСТНОЙ ТКАНИ

Лабораторная работа № 22.

Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови кинетическим методом


Принцип метода: Щелочная фосфатаза (ЩФ) в сыворотке определяется путем измерения скорости гидролиза эфира фосфорной кислоты – п-нитрофенилфосфата.


п-Нитрофенилфосфат ----------- п-нитрофенол + Н3РО4


Скорость гидролиза субстрата прямо пропорциональна активности ЩФ в пробе и изеряется спектрофотометрически при длине волны 405 нм.
^ Линейность метода: до 800 Е/л.

Норма: 35-123 Е/л (37С).
ЩФ в негемолизированной сыворотке сохраняет стабильность при температуре хранения 2-8С в течение 2 дней.
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 405 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 25 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови;

  5. Дистиллированная вода;

  6. Рабочий реагент (субстрат – 10 ммоль/л в буфере (рН 10,10,1)).

Рабочий реагент годен для применения, если его оптическая плотность выше 1,0 ед.опт.плотн. при длине волны 405 нм.
^ Проведение анализа
Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37С).


^ Добавить в кювету

Опытная проба

1. Сыворотка

25 мкл

2. Рабочий реагент

1 мл


Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Измерить оптическую плотность пробы против дистиллированной воды при длине 405 нм ровно через 1 мин. Повторить измерение 3 раза с интервалом 1 мин. Рассчитать изменение оптической плотности за каждую минуту, а затем вычислить среднее измерение оптической плотности в минуту (о.п./мин).
Расчет
Расчет по фактору активности ЩФ проводят по формуле:


о.п./мин  1,025  1000

АЩФ (Е/л) = ----------------------------------- = о.п./мин  2187,

18,75  0,025  1,0


где о.п./мин – среднее изменение оптической плотности в минуту;

1,025 – общий объем раствора в кювете;

1000 – коэффициент перевода мл в л;

18,75 – коэффициент миллимолярного поглощения п-нитрофенола;

0,025 – объем сыворотки в мл;

1,0 – длина оптического пути.
При внесении каких-либо изменений в перечисленные параметры фактор следует пересчитать. Если активность ЩФ превышает 800 Е/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.
Клинико-диагностическое значение: Увеличение активности ЩФ в сыворотке крови наблюдается при костных заболеваниях. Это связано с более интенсивным синтезом костного изофермента в остеобластах, либо с увеличением количества самих остеобластов.

Наиболее высокая активность ЩФ (выше нормы в 20 раз и более) определяется при деформирующем остите (болезнь Педжета), менее высокая – при рахите. Злокачественные заболевания кости также характеризуются поышеннми уровнями активности ЩФ. При гиперпаратиреоидизме концентрация фермента в сыворотке повышается незначительно.

Резкое увеличение активности ЩФ наблюдается при механической желтухе. В меньшей степени активность фермента повышается при гепатите и циррозе печени. Повышение активности фермента в сыворотке при заболеваниях печени и желчевыводящих путей связано с высвобождением печеночной ЩФ в кровь из поврежденных гепатоцитов, либо с задержкой экскреции изофермента с желчью при обструкции желчевыводящих протоков.

Самый термостабильный и малоподвижный при электрофорезе изофермент ЩФ принадлежит плаценте. Сходные свойства с ним имеет и ЩФ злокачественных новообразований.

Лабораторная работа № 23.

Определение концентрации кальция в сыворотке крови


Принцип метода: Кальций в растворе при нейтральном значении рН образует с красителем Арсеназо  окрашенный комплекс синего цвета.

Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации кальция в нем.
^ Линейность метода: 0,01-6,25 ммоль/л.

Норма: 2,15-2,57 ммоль/л.
Оборудование и реагенты:

  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 650 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 20-37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 10 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови;

  5. Реагент (Арсеназо  120 мкмоль/л в фосфатном буфере, рН 7,5 – 50 ммоль/л);

  6. Стандарт (раствор Са2+ 2,5 ммоль/л).


Проведение анализа


^ Добавить в кювету

Опытная проба

Холостая проба

Стандартная проба

1. Сыворотка

10 мкл

--

--

2. Стандарт

--

--

10 мкл

3. Реагент

1 мл

1 мл

1 мл


Перемешать содержимое в пробирках, инкубировать 2 минуты. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 650 нм. Окраска раствора стабильна в течение 40 минут.
Расчет
Расчет по стандарту концентрации кальция в сыворотке проводят по формуле:


Аоп

С (ммоль/л) = -----------  Сст,

Аст


где Аоп / Аст – оптическая плотность пробы или стандарта;

Сст – концентрация стандарта.
Если концентрация кальция превышает 6,25 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Для измерений рекомендуется использовать одноразовую посуду. Следовые количества хелатирующих веществ (например, ЭДТА), которые могут присутствовать в детергентах, препятствуют образованию окрашенного комплекса.
Клинико-диагностическое значение: Содержание кальция в сыворотке крови повышается выше нормы при массивных распадах костей, гиперпаратиреоидизме, гипервитаминозе D.

Концентрация кальция в сыворотке падает при гипопаратиреоидизме, гиповитаминозе D, а также при некоторых почечных тубулопатиях и синдроме мальабсорбции.

Лабораторная работа № 24.

Определение концентрации фосфора в сыворотке крови


Принцип метода: Неорганический фосфор (фосфаты) образует с молибденовой кислотой фосфорномолибденовую гетерополикислоту. Последняя реагирует с красителем малахитовым зеленым с образованием комплекса, окрашенного в сине-фиолетовый цвет.

Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации фосфора в нем. Белок сыворотки не мешает проведению реакции. Детергент способствует устойчивости образовавшегося комплекса в растворе.
^ Линейность метода: до 3 ммоль/л.

Норма: 1-2 ммоль/л неорганического фосфора.


Оборудование и реагенты:


  1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 600-650 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 20-37С;

  2. Секундомер;

  3. Автоматические пипетки на 20 мкл и 1000 мкл;

  4. Сыворотка крови;

  5. Цветной реагент (Малахитовый зеленый 0,3 %, молибдат аммония 2,1% в 5 н. соляной кислоте);

  6. Раствор детергента (Твин 20, 1,5%);

  7. Стандарт (раствор КН2РО4, 1,0 ммоль/л);

  8. Деионизированная вода.


Проведение анализа


Добавить в кювету

Опытная проба

^ Холостая проба

Стандартная проба

1. Сыворотка

20 мкл

--

--

2. Стандарт

--

--

20 мкл

3. Деионизирован-ная вода

1,5 мл

1,5 мл

1,5 мл

4. Цветной реагент

2 мл

2 мл

2 мл

5. Раствор детергента

1 капля

1 капля

1 капля


Перемешать содержимое в пробирках, инкубировать 15 минут. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 600-650 нм. Окраска раствора стабильна в течение 20 минут.
Расчет
Расчет по стандарту концентрации фосфора в сыворотке проводят по формуле:


Аоп

С (ммоль/л) = -----------  Сст,

Аст


где Аоп / Аст – оптическая плотность пробы или стандарта;

Сст – концентрация стандарта.
Если концентрация фосфора превышает 3,0 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Для измерений рекомендуется использовать одноразовую посуду
Клинико-диагностическое значение: Неорганический фосфор увеличивается в сыворотке при почечной недостаточности, гипопаратиреоидизме, передозировке витамина D. Уменьшение концентрации фосфора в сыворотке наблюдается при рахите, гиперпаратиреоидизме, почечных тубулопатиях и синдроме мальабсорбции.

ПРИЛОЖЕНИЕ





1   2   3   4   5   6



Скачать файл (47.4 kb.)

Поиск по сайту:  

© gendocs.ru
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации
Рейтинг@Mail.ru