Logo GenDocs.ru

Поиск по сайту:  

Загрузка...

Автореферат диссертации - Неинструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц - файл 1.doc


Автореферат диссертации - Неинструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц
скачать (2501 kb.)

Доступные файлы (1):

1.doc2501kb.19.11.2011 23:48скачать

содержание

1.doc

  1   2   3
На правах рукописи
РАЕВ

Михаил Борисович
НЕИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ

НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОЧАСТИЦ

14.00.46 − клиническая лабораторная диагностика,

14.00.36 − аллергология и иммунология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург − 2008
Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов

Уральского Отделения Российской академии наук, г. Пермь

Научные консультанты:

академик РАН, академик РАМН,

д.м.н., профессор ^ Черешнев Валерий Александрович

доктор медицинских наук Шмагель Константин Владимирович


Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Зыбина Наталья Николаевна

доктор медицинских наук профессор ^ Серебряная Наталья Борисовна

доктор медицинских наук профессор Климович Владимир Борисович


Ведущая организация:

ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию МЗСР РФ


Защита состоится «24» апреля 2008 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2).

Автореферат разослан «___» _____________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

д.м.н. профессор Алексанин С.С.

^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современной аналитической практике разрабо­тан ряд методов иммуноанализа, каждый из которых условно можно разделить на три стадии: формирование специфического комплекса антиген-анти­тело, введение в него метки и ее регистрация тем или иным спо­собом. К таким методам можно отнести радиоиммунологический ана­лиз [Yallow, Berson, 1959], иммуноферментный анализ [Engvall, Perlmann, 1971, 1972, Weemen, Schuurs, 1971, Rubinstein et al., 1972], био- и хемилюминесцентные иммуноанализы [Woodhead, Weeks, 1985, Ullman et al., 1996], флюориметрический анализ [Frank, 1978, Frengen et al., 1993] и его микрообъемные модификации [Swartzmann et al., 1999, Zuck et al., 1999, Martens et al., 1999], анализ проточной цитометрией [Fulwyler, 1976, Cook, Irving, 1989, Frengen et al., 1993, McHugh, 1994]. Все перечисленные методы обладают рядом положительных качеств: универсальностью, т.е. позволяют определять любое соединение, против которого воз­можно получить специфические антитела, избирательностью и специ­фичностью, высокой чувствительностью. Однако наряду с досто­инствами, у них есть некоторые недостатки. В частности, опасность для здоровья, связанная с использованием изотоп­ных меток в радиоиммунологических исследованиях (РИА), токсичные и канцерогенные свойства хромогенных субстратов, применяемых в иммуноферментном анализе (ИФА). Кроме того, ряд методов зависит от сложной и дорогостоящей регистрирующей аппаратуры, обладает трудоемкостью и относительной длительностью исполнения (РИА, хемилюминесцентный и флуоресцентный, анализы, проточная цитометрия).

К настоящему времени достаточно хорошо известны системы анализа с прямым мечением специфичных по отношению к определяемому веществу (лиганду) аффинных соединений (ан­ти-лигандов) оптически плотными частицами или цветными полимерами различной природы и размеров. Среди таких меток следует отметить латексы, в том числе цветные [Remington et al., 1983, Bangs, 1987, 1996, Lin You-chu et al., 1989, Gerber et al., 1990, Tarcha et al., 1990], эритроциты [Guesdon, Avrameas, 1980, Плаксин, 1986], неметаллические коллоиды серы, селена, теллура [Spallholz, 1982, Yost et al, 1989, Russel et al, 1989], оксиды металлов [Akzo, 1980, Zelikman, Hjerten, 1988], полимеризованные коллоидные красители, [Snowden, Hommel, 1991], гидрофобные красители [Gribnau et al., 1985, Anderson, 1988, Rounds, 1988], коллоидное золото [Moeremans et al., 1984, Egger, Bienz, 1987., Roth, Heitz, 1989, Chakraborty at al., 1990, Martin et al., 1990]. Использование данных меток позволяет визуально определять присутствие лиганда как в гомогенных системах анализа (без раз­деления реагирующих компонентов), так и в многочисленных гете­рогенных системах. К первой группе можно отнести агглютинацию до­вольно крупных частиц (с размерами от 0,2 до нескольких микро­метров) или изменение спектральных характеристик (цвета) специ­фически агглютинирующих коллоидов. Ко второй – системы, основанные на эритроиммуноадсорбции и, более широко, на седиментационно-адсорбционном (иммуно)анализе; дот-, Вестерн-, Сау­зерн-, Нозерн-блоттинге; иммуно- и гибридофильтрации (flow-through анализах), иммунохроматографии (иммуномиграции) и ряде других процедурных аранжировках, результат которых оценивают по окрашиванию зоны специфического связывания лиганда на непористом или пористом твердофазном носителе. Несмотря на возможность количественной регистрации с использованием простых колориметров, рефлектометров, денситометров, основным преи­муществом перечисленных методов является прямое визуальное опре­деление лиганда, что условно выделяет их в группу так называемых безинструментальных методов.

Основными недостатками отмеченных методов являются неудовлетворительная надежность систем анализа и плохая воспроизводимость результатов, обусловленные слабой стабильностью диагностических реагентов, а также относительно низкая чувствительность, связанная с невысокой хромофорностью используемых в качестве меток частиц.

Решение перечисленных проблем получило свою реализацию в работах, в которых в качестве меток детектирующих реагентов применили частицы коллоидного углерода [Плаксин и др., 1991, 1994, 1997]. Основным моментом этих разработок стала двухэтапная технологическая схема синтеза углеродных конъюгатов, предусматривающая ковалентное связывание аффинных соединений с частицами углерода. Решение коснулось сразу двух аспектов проблемы. Черный цвет углеродных частиц обеспечил максимальную из существующих в природе хромофорность меток, а ковалентный характер связи аффинных соединений с ними – максимальную прочность структуры диагностикума.

Важным результатом разработанной технологии явилось получение устойчивой гетерогенной системы, обладающей одновременно свойствами истинного раствора и суспензии, названной авторами «суспензоидом». Частицы углерода размерами 162 нм, обладающие реальной поверхностью и находящиеся в водной фазе, не оседали и не всплывали под действием обычной гравитации.

Однако двухэтапный метод конъюгирования отягощен рядом технологических сложностей. В первую очередь это касается необходимости проведения двух хроматографических процедур: освобождение от избытка сорбируемого полимера и бифункционального реагента на первом этапе, и, как следствие, необходимость концентрирования, за которым вновь следует процедура хроматографического удаления несвязавшихся молекул анти-лиганда. Подобная многоэтапность не только удлиняет описанный способ, но и делает его трудоемким, мало технологичным, затратным. Кроме того, использование в качестве сорбируемого с целью пептизации поверхности углеродных частиц инертного белка – бычьего сывороточного альбумина (БСА) ограничивает количество связываемого аффинного соединения, что, в конечном итоге, накладывает ограничения на уровень чувствительности стереоспецифического анализа, проводимого с использованием таких конъюгатов.

Вместе с тем, сконструированные модели тест-систем на основе полученных реагентов в полной мере продемонстрировали перспективные возможности применения углеродных конъюгатов для создания аналитических систем, пригодных для диагностического тестирования.

^ Цель настоящей работы - разработка универсальной технологии одноэтапного синтеза диагностических реагентов с использованием углеродных наночастиц и конструирование на ее основе систем безинструментально­го иммуноанализа.

^ Основные задачи исследования:

1. Разработать технологию синтеза углеродных диагностикумов, предусматривающую одноэтапное конъюгирование аффинных соединений с наночастицами коллоидного углерода. Изучить стабильность полученных конъюгатов.

2. Обосновать универсальную систему диагностического тестирования, основанную на определении иммуноглобулинов класса G с использованием в качестве аффинного соединения белка G стрептококка и оценить ее основные аналитические параметры.

3. Обосновать системы иммуноаналитического определения различных лигандов в различных процедурных аранжировках.

4. Разработать методы аналитического тестирования на основе биотин-стрептавидинового взаимодействия.

^ Научная новизна и теоретическая значимость исследования. Впервые разработана одноэтапная технологическая схема ковалентного конъюги­рования аффинных соединений с гидрофобными наночастицами коллоидного углерода, пригодная для промышленного внедрения, позволившая химически инертному углероду стать прочно связанным с биологическими макромолекулами. Компактность и универсальность разработанной технологии, подбор оптимальных параметров синтеза и технологических приемов позволили в условиях использования лабораторной модели технологической установки получить объем диагностических реагентов, обеспечивающий проведение до 300000 определений в год. Технологический процесс можно легко масштабировать, не опасаясь негативных последствий, которыми, как правило, сопровождаются любые действия, связанные с переносом лабораторной схемы в условия реального производства.

Впервые предложен и апробирован оригинальный и эффективный способ получения углеродных частиц с высокой степенью стандартизации по размерам.

Полученные данные дополняют современный биотехнологический арсенал методов принципиально новой технологией, позволяющей получать устойчивые водные суспензии гидрофобных наночастиц, поверхность которых может быть надежно модифицирована практически любыми соединениями, имеющими в своей структуре хотя бы одну свободную аминогруппу. Технология синтеза диагностикума и способы анализа с использованием синтезируемых углеродных реагентов защищена патентами РФ № 2089212 от 10.09.1997, № 2268471 от 20.01.2006, № 2283131 от 10.10.2006, № 2302424 от 10.07.2007. Кроме того, получены положительные решения о выдаче патентов на изобретения по заявкам № 20051128104/15(031560) от 05.02.2007, № 2007103808/15(004097) от 30.10.2007 и № 2007100406/15(000429) от 09.10.2007.

Использование разработанной технологии позволило получить устойчивые диагностические реагенты, которые характеризуются стабильностью в течение длительного времени, даже в условиях значительного отклонения от оптимальных параметров хранения. Это составило основу надежности тест-систем, конструируемых с использованием углеродных конъюгатов.

Привлекательные с позиций надежности и стабильности характеристики полученных реагентов позволили существенно упростить процедурное оформление анализов без ущерба для аналитических параметров готовых тест-систем.

Разработка технологии одноэтапного синтеза углеродных конъюгатов позволила повысить чувствительность определения различных лигандов в разных форматных аранжировках анализа.

Впервые на углеродных конъюгатах продемонстрированы преимущества систем анализа, эксплуатирующих уникальные свойства биотин-стрептавидинового взаимодействия, как в аспекте универсальности детекции, так и в возможности амплифицированного усиления результата аналитического исследования, повышающего чувствительность определения.

^ Практическая значимость исследования.

Разработанные методические подходы в сфере конструирования неинструментальных аналитических систем могут служить основой для создания широкого спектра разнообразных наборов, пригодных для диагностического тестирования. Это могут быть системы анализа для клинико-лабораторных исследований, для экспресс диагностики в кабинете врача по принципу «один пациент - один тест», для скрининговых исследований в чрезвычайных ситуациях, для работы бригад скорой помощи, домашние тесты, полевые – в условиях экспедиционных отрядов и армейских подразделений. Быстрые и надежные, а вместе с тем, чрезвычайно простые в использовании, тесты могут найти свое применение в пищевой промышленности, в криминалистике, в ветеринарии и растениеводстве для оснащения не только контрольных лабораторий, но и фермерских хозяйств и т.д. В условиях исследовательских лабораторий наличие подобных диагностических инструментов может обеспечить возможность самостоятельного конструирования актуальных тест-систем. Например, достаточно иметь конъюгат белка G с углеродом, чтобы при необходимости сконструировать систему обнаружения и идентификации любых иммуноглобулинов. Это бывает весьма актуально там, где проводятся работы, связанные с выделением и очисткой белковых соединений из различных биологических материалов. То же касается и стрептавидинового конъюгата, как универсального детектирующего реагента, способного обнаружить любой лиганд при одном лишь условии – наличии соответствующего биотинилированного анти-лиганда.

^ Внедрение в практику. Результаты работы используются в практической деятельности лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН при оценке иммуноглобулиновой контаминации препаратов выделяемых белков фетоплацентарного комплекса, при оценке уровня сероконверсии в период иммунизации экспериментальных животных, в экспериментально-производственной работе филиала ФГУП НПО «Микроген» «Пермский НПО «БИОМЕД», в работе Института новых медицинских технологий (г.Краснокамск), в учебном процессе на биологическом факультете Пермского госуниверситета.

^ Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная технология одноэтапного конъюгирования различных аффинных соединений с частицами коллоидного углерода позволяет получать детектирующие реагенты прочной ковалентной структуры за счет единовременного процесса пептизации, активации и связывания всех компонентов диагностикума. Получаемые конъюгаты устойчивы при хранении в течение длительного времени даже в условиях отклонения температуры окружающей среды от оптимальной.

2. Получение стабильных конъюгатов на основе углеродных наночастиц дает возможность конструировать широкий спектр систем анализа, как с высокой степенью универсальности, так и с узко направленными задачами определения конкретных лигандов, отвечающих основным требованиям, предъявляемым к диагностическим системам: высокие чувствительность и специфичность, воспроизводимость, надежность, простота, оперативность.

3. Использование в конструкции аналитических систем уникальных свойств биотин-стрептавидинового взаимодействия приводит к существенному усилению чувствительности определения при создании широкого спектра диагностических тест-систем на основе наночастиц углерода.

Связь работы с крупными программами. Работа проводилась в течение 1991-2007 гг. в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН (номер госрегистрации темы НИР 01.9.00.017989), а также в рамках федеральной программы «Старт 05».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на LXII сессии общего собрания Академии медицинских наук СССР, Москва, 1991, на Международном симпозиуме «Проблемы загрязнения окружающей среды, токсикология», Пермь-Москва, 1991, на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994, на Международном симпозиуме «Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология», Москва-Пермь, 1993, на Международной конференции по иммунореабилитации, Сочи, 1994, на Международном симпозиуме ICACI XV-EAACI'94, Стокгольм, Швеция, 1994, на Международной конференции по нейроиммунным взаимодействиям и загрязнению окружающей среды (ICONE’95), Санкт-Петербург, 1995, на XIII-м Ленсфилдском международном симпозиуме по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, на Выставке достижений Российской биотехнологии, Берлин, Германия, 1996, на 4-м Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарства», Москва, 1997, на Международной конференции AAAAI/AAI/CIS, Сан-Франциско, США, 1997, на Конгрессе FASEB, США, 1998, на Международной конференции по загрязнению окружающей среды (ICEP’98), Москва, 1998, на Ежегодном собрании профессиональных ученых, Экспериментальная биология 98, Сан-Франциско, Калифорния, США, 1998, на Международном семинаре «Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса», ISTC, Perm, Russia, 2001, на I-II конференциях иммунологов Урала, Екатеринбург, 2001, Пермь, 2002, на Всероссийском съезде иммунологов России, Екатеринбург, Россия, 2004, на IX Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге. Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии», 2005, на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет», Новосибирск, 2005, на IV, V и VI конференциях иммунологов Урала, Уфа, 2005, Оренбург, 2006, Ижевск, 2007, на Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», Курск, Россия, 2006, на 2-й Республиканской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты», Сочи, 2007.

Публикации. Материалы диссертации обобщены в 64 печатных работах, из них: 13 статей, включая 5 статей в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ, 4 патента РФ на изобретение и 3 положительных решения о выдаче патентов РФ.

^ Объем и структура работы. Работа изложена на 217 страницах, содержит 8 таблиц и 36 рисунков, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения и выводов. Список литературы включает 419 источников, в том числе: 50 на русском и 369 на английском языках.

^ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы. Растворы всех использованных в работе реагентов готовились на деионизированной воде с сопротивлением не менее 18 Мом. Были использованы реагенты: хлорид натрия, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, бы­чий сывороточный альбумин, азид натрия, додецилсульфат натрия, карбонат и бикарбонат натрия, сахароза производства фирмы Sigma (США); углерод, полученный по собственной технологии; толуол, гептан, гексан, диметилформамид производства Реахим (Россия), 4-Cl-1-нафтол фирмы Sigma (США); Твин-20 про­изводства фирмы Ferak (ФРГ); хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), моноклональные антитела AB 0422 клона 1058 против β-субъединицы ХГЧ, моноклональные антитела AB 0420 клона 1001 против α-субъединицы ХГЧ, антитела к стрептококку группы А (СГА), конъюгат козлиных антител к стрептококку гр. А с HRP производства фирмы Binax (США); антистрептококковая кроличья референс-сыворотка фирмы Wellcome (Великобритания); группоспецифическая лиофилизированная ослиная антистрептококковая сыворотка НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, кроличья антистрептококковая сыворотка, литический комплекс из Streptomyces levoris 96, культура клеток стрептококка гр. А штамма № 6/49 типа М29 Пражской коллекции культур были получены в лаборатории стрептококковых инфекций ММА им. И.М.Сеченова, группоспецифический полисахарид стрептококка группы А, конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином (АПСХ-БСА) был любезно предоставлен научным сотрудником НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи к.х.н. В.А.Кульшиным, се­фароза 6В-CL производства фирмы Pharmacia Fine Chemicals (Швеция); рекомбинантный белок G (Protein G from Streptococcus sp. Recombinant) фирмы Sigma (США); стандартные панели сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в низких концентрациях серий 006, 007 и 008 и стандартная па­нель сывороток, не содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) серии 004 производства НПО "Вектор" (Россия); антиботулинические и антистолбнячные антитела были выделены из коммерческих препаратов специфических антисывороток; ботулинический и столбнячный анатоксины получены из ГИСКа им. Л.А.Тарасевича; альфа-фетопротеин (АФП) и поликлональные антитела к АФП получены в ходе выполнения совместной работы с Институтом новых медицинских технологий, г. Краснокамск (ген. директор К.Ю. Новиков), моноклональные антитела к трофобластическому β-1-гликопротеину (ТБГ) и ТБГ получены самостоятельно; стрептавидин, стрептавидин, меченый пероксидазой хрена, N-гидроксисукцинимидный эфир аминокапроид­биотина производства ИЦПП "Пептос" (Россия); рекомбинантные поли­пептиды, продукты генов "envI", "envII", "gagI", "polI", контрольные сыворотки, содержащие антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, контрольная сыворотка крови человека, не содержащая антитела к ВИЧ производства БТК "Биосер­вис" (Россия), IgG человека, кролика, мыши, антитела овцы против IgG кролика, антитела кролика против IgG человека производства Sigma (США).

В качестве основы для конструирования твердофазных реагентов использовали различные полимерные материалы: непористые, изготовленные из полистирола, пористые – из нитроцеллюлозы. В частности: планшеты для серийных разведений из белого полистирола про­изводства фирмы Linbro (США); нитроцеллюлозные мембраны 0,45 мкм BA-85, 5,0 мкм AE-98 производства фирмы Schleicher & Schuell (ФРГ), LC 5 мкм и 10 мкм производства Millipore (США), Trans-Blot Transfer Medium, Pure Nitrocellulose Membrane 0,45 мкм, Био-Рад (США); диализные мешки Visking Dialysis Tubing производства фирмы Serva (Германия).

В работе использовали следующие буферные растворы:

1. 0,15 М раствор NaCl, забуференный 0,015М Na-фосфатами, pH 7,25 (ЗФР);

2. ЗФР с 0,05% Твина 20 (ЗФРТ);

3. 0,02 М комплексирующий карбонатно-бикарбонатный буфер, pH 9,6 (КББ);

4. 0,1 М карбонатно-бикарбонатный буфер, pH 8,6.

5. Блокирующий раствор – ЗФРТ, содержащий 1% казеина (ЗФРТ-К)

Методы

1. Биотинилирование антител проводили по Goding J.W. [1980].

К 0,9 мл раствора антител в концентрации 1 мг/мл, предварительно от­диализованного в течение 12 часов против 0,1 М карбонатно-бикар­бонатного буфера pH 8,6, добавляли 0,1 мл ДМСО, содержащего 0,1 мг N-гидроксисукцинимидного эфира аминокапроидбиотина. После четырех часов инкубации при комнатной температуре диализовали против ЗФР, содержащего 0,1% азида натрия, с целью удаления нес­вязавшегося эфира биотина при +4оС в течение 12-14 часов.

Биотинилирование БСА проводили по аналогичной схеме.

2. Проявление пероксидазы в дот-ELISA проводили с использова­нием субстратной смеси следующего состава:

3,5 мл 0,05 М Трис-НCl с 0,15 М NaCl pH 7,5;

1,5 мл 4-Cl-1-нафтол (10 мг/мл этилового спирта);

16 мкл 3% перекись водорода.

3. Ферментную детекцию при определении антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 проводили реагентами из набора "Блот-ВИЧ" БТК "Биосервис" (Россия) по инструкции производителя.

4. Концентрирование проводили в диализных мешках в сухом Фиколле 400 производства Serva (Германия).

5. Определение белка проводили по Bradford M.M. [1976].

6. Гетерогенность реагентов оценивали электрофоретически в ПААГ [Laemmly V.K., 1970] и по результатам HPLC на хроматографе Hitachi JC 400 с колонкой TSK G2000SW (Япония) по рекомендации производителя.

7. Очистку иммуноглобулинов осуществляли гель-хроматографией на колонке 2,6 см х 80 см (LKB, Швеция). В качестве носителя использовали Сефакрил S-300 Pharmacia Fine Chemicals (Швеция).

8. Ультразвуковую дезинтеграцию частиц углерода производили на дезинтеграторе УЗДН-2М (Россия) при частоте 22 кГц.

9. АФП получали из абортной крови по оригинальной технологии. Для этого кровь центрифугировали в течение 1 часа при 6000 g и наносили на сорбент: поликлональные антитела к АФП человека/сефароза. После нанесения и отмывки сорбента белок элюировали 0,1 М глицин-HCl буфером с рН 2,5 - 2,6, диализовали против физраствора и проводили негативную хроматографию на сорбенте поликлональные антитела к IgG человека/сефароза 4В с целью извлечения примесных иммуноглобулинов. Полученный препарат был электрофоретически гомогенен.

10. Поликлональные антитела получали иммунизацией коз (возраст 2-8 лет, масса 30-35 кг) препаратом АФП. Первичную иммунизацию проводили раствором АФП с полным адъювантом Фрейнда из расчета 0,3 мг/кг массы тела животного инъекцией в предлопаточный лимфатический узел и подкожно в область холки. Повторную иммунизацию проводили через три недели чистым АФП, который вводили внутривенно, подкожно и внутримышечно. Забор крови проводили через 4 недели.

Выделение антител из крови осуществляли аффинной хроматографией, которую проводили после центрифугирования и сульфатаммонийного фракционирования сыворотки крови иммунизированного животного. Фракцию, содержащую иммуноглобулины, наносили на сорбент АФП/сефароза CL-6B. После отмывки колонки антитела элюировали 0,1 М глицин-НCl буфером рН - 2,55, диализовали против забуференного физраствора и концентрировали до 10 мг/мл.

11. Моноклональные антитела к ТБГ получали из культуральной среды гибридомы BAP3 (лаборатория клеточных культур, зав. лаб. Орит Лейтер, центр биологических исследований Вейцмана, Израиль). Для этого среду, содержащую антитела, наносили на сорбент белок G/сефароза FF. После отмывки сорбента антитела элюировали 0,1 М глицин-HCl буфером (рН 2,6) и диализовали против ЗФР.

12. ТБГ получали из сыворотки крови беременных женщин на сроках беременности свыше 37 недель по оригинальной технологии. Для этого сыворотку крови, предварительно фракционированную сульфатом аммония, наносили на сорбент моноклональные антитела к ТБГ/сефароза CL-4B. Элюцию проводили как описано выше. Полученный препарат после диализа доочищали на колонке с противовидовыми анти-лигандами.

13. Сорбент моноклональные антитела к ТБГ/сефароза CL-4B получали конъюгацией полученных антител с бромцианактивированной сефарозой CL-4B по методике производителя (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция).

14. Детектирующие реагенты, полученные и использованные в работе представлены в таблице 1.

Таблица 1

^ ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО ПРОВЕДЕННЫХ ОДНОЭТАПНЫХ СИНТЕЗОВ

№ п/п

Аффинное соединение, конъюгированное с углеродными частицами

Количество синтезов

1

Стрептавидин

24

2

G белок

13

3

Моноклональные антитела к ХГЧ

8

4

Биотинилированный БСА

2

5

Поликлональные антитела к АФП

3

6

Поликлональные антитела к СГА

3

7

Моноклональные антитела к ТБГ

1

15. Объекты исследования и число проведенных определений представлены в таблице 2.


Таблица 2

^ ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО ИССЛЕДОВАННЫХ ОБРАЗЦОВ И ПРОВЕДЕННЫХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ

№ п/п

Объект определения

Среда определения

Кол-во образцов/число определений

1

Антитела к ВИЧ-1

Сыворотка крови

202/2626

2

Антитела к ВИЧ-2

Сыворотка крови

12/156

3

Антитела к ВИЧ-1

Стандартная панель ВИЧ-1 позитивных сывороток

3/39

4

Антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2

Донорская сыворотка

114/1482

5

ХГЧ

Моча беременных женщин

58/464

6

ХГЧ

Стандарт фирмы Binax (США)

1/136

7

Антитела к стрептококкам гр.А

Кроличья антистрептококковая сыворотка из лаборатории стрептококковых инфекций ММА им. И.М.Сеченов

1/60

8

Антитела к стрептококкам гр.А

Группоспецифическая лиофилизированная ослиная антистрептококковая сыворотка НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи

1/30

9

Антитела к стрептококкам гр.А

Антистрептококковая кроличья референс-сыворотка фирмы Wellcome (Великобритания)

1/130

10

АПСХ-БСА

НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи

1/81

11

АПСХ

Культура клеток стрептококка гр. А штамма № 6/49 типа М29 Пражской коллекции культур

1/48

12

АПСХ

Смыв с мазка из зева

34/102

13

ХГЧ

Сыворотки крови беременных женщин

18/144

14

АФП

Сыворотки крови беременных женщин

18/54

15

ТБГ

Сыворотки крови беременных женщин

18/18

16

Поликлональные антитела к АФП

Сыворотки иммунизированных коз

4/24

17

Столбнячный анатоксин

НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи

1/15

18

Ботулинический анатоксин

НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи

1/15

19

IgG человека

Стандарт фирмы Sigma (США)

1/220

20

IgG кролика

Стандарт фирмы Sigma (США)

1/78

21

IgG мыши

Стандарт фирмы Sigma (США)

1/78

22

Кроличьи антитела к IgG человека

Референс-стандарт фирмы Sigma (США)

1/130

23

Биотинилированный БСА

Синтезирован самостоятельно

11/240

24

IgG человека

Моча урологических больных

32/192

  1   2   3



Скачать файл (2501 kb.)

Поиск по сайту:  

© gendocs.ru
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации