Logo GenDocs.ru

Поиск по сайту:  

Загрузка...

Реферат - Физические методы в биологии. Транскрипция. Кэпирование. Полиаденилирование. Сплайсинг - файл 1.doc


Реферат - Физические методы в биологии. Транскрипция. Кэпирование. Полиаденилирование. Сплайсинг
скачать (86 kb.)

Доступные файлы (1):

1.doc86kb.05.02.2012 10:31скачать

содержание

1.doc

Вопрос № 1. Физические методы в биологических исследованиях.

Стремительное развитие молекулярной биологии и поразительные успе­хи, которых она достигла за последние 10­ -15 лет, во многом обусловлены применением современных физических методов исследования. Эти методы непрерывно совершенствуются и обладают в настоящее время очень большими возможностям­: позволяют видеть биологические макромолекулы, определять положение в пространстве каждого атома в молекулах глобулярных белков, замечать тонкие изменения формы молекул биополимеров в растворе, разделять в центробежном поле молекулы, лишь ничтожно отличающиеся одна от другой, и т. д.

1.Рентгеноструктурный анализ биополимеров.

Значительную роль в развитии структурных исследований биополимеров сыграл рентгеноструктурный анализ ­ метод, позволяющий определять пространственное расположение атомов в молекулах исследуемых соединений. Методы, применяемые при рентгенографических исследовани­ях монокристаллов и волокон, различны.

^ Кристаллы белков и вирусов.

Очень многие белки могут кристаллизоваться. Кристаллизуются также и более сложные соединения, например вирусы, которые представляют собой комплексы белков с нуклеиновыми кислотами. Образующиеся при этом кристаллы по многим своим свойствам соответствуют тому, что принято называть кристал­лом в классическом смысле этого понятия. Они имеют xapaктерную внешнюю oгpaнку. Рентгенограммы свидетельствуют о достаточной правильности их трехмерной кристаллической решетки.

^ Исследование строения фибриллярных структур.

Биологические полимеры, молекулы, которых имеют нитевидную форму, образуют волокнистые, или, иначе, фибриллярные, структуры. Подобные структуры составляют основу многих тканей живого организма. Например, мышечные волокна, соединительная ткань, кожные покровы, роговые образования состоят главным образом из фибриллярных белков. Нитевидные молекулы ДНК и некоторых видов РНК имеют также определенную тенденцию к образованию волокон. Такие волокна могут быть получены искусственно из концентрированных растворов этих соединений. Легко образуют фибриллярные структуры и высокомолекулярные синтетические полипептиды и полинуклеотиды. Некоторые глобулярные белки могут полимери­зоваться, при этом возникают линейные агрегаты их молекул. Такие «бусы», построены из глобулярных частиц, также образуют волокна. Волокна могут быть получены и из концентрированных растворов вируса табачной мозаики (ВТМ), так как частицы этого вируса имеют высокую степень асимметрии. Исследования строения волокон биополимеров ­ очень важный и интересный раздел молекулярной биологии. Именно они привели к двум фундаментальным открытиям ­ к определению структуры альфа-спирали и установлению структуры ДНК.

2.Электронная микроскопия.

Электроны, проходя через вещество объекта, изменяют свои траектории,­ рассеиваются. Число рассеянных электронов возрастает с увеличением плотности вещества, его атомного номера, толщины образца и уменьшением энергии электронов. Биологические макромолекулы для исследования их в электронном микроскопе размещаются на тончайших пленках – под­ложках. В свою очередь, опорой для этих пленок служат специальные сетки, изготовленные из меди электролитическим способом или сплетенные из тонкой проволоки. В практике электронномикроскопических исследований биологических макромолекул чаще всего используются коллодиевые и углеродные пленки.

^ Методы контрастирования молекул белков, нуклеиновых кислот, вирусов.

Контрастирование оттенением прежде всего производится испарение металла в вакууме. При этом атомы металла разлетаются от места испарения по прямолинейным траекториям. Этот метод позволяет не только увеличить контрастность изображения, но и установить размеры исследуемых объектов. Чаще всего для оттенения белковых молекул, вирусов, нуклеиновых кислот, рибосом используются платина, палладий, сплав платины с палладием, вольфрам, реже ­ уран.

^ Метод углеродных реплик с предварительным оттенением. Метод реплик заключается в том, что рельеф поверхности объекта воспроизводится при помощи тонкой пленки, которая затем исследуется в электронном микроскопе.

^ Негативное контрастирование. Если частицы исследуемого объекта, например вирусы или отдельные белковые молекулы, находятся на пленке­подложке в тонком слое аморф­ного вещества высокой плотности, то на экране микроскопа они будут выглядеть как светлые объекты на темном фоне. В этом и заключается принцип «негативного» контрастирования.

^ Позитивное контрастирование. За последние годы получило широкое распространение избирательное «окрашива­ние» срезов водорастворимыми слоями тяжелых металлов с целью выявления участков, занимаемых нуклеиновой кислотой. Физическая сущность такого окрашивания заключается в присоединении ионов тяжелых, сильно рассеивающих электроны металлов к молекулам нуклеиновой кислоты. Каплю суспензии вирусов помещают на покрытую углеродной пленкой сетку. Сетку с пленкой выдерживают в течение нескольких часов в 2%-ном водном растворе уранилацетата, после чего промывают водой. В результате такой обработки центральная часть вирусов, где расположена их нуклеиновая кислота, становится ви­димой в электронном микроскопе и на микрофотографии выглядит как темное пятно.

^ 3.ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

Инфракрасная спектроскопия.

При поглощении света с данной частотой молекула или атом получают соответствующий квант энергии или, как говорят, пе­реходят на более высокий энергетический уровень. В инфракрасной области поглощается свет именно тех частот, которые равны частотам колебаний атомов в молекуле.

Спектрополяриметрия.

Метод дисперсии оптической активности в настоящее время стал одним из основных методов исследования структуры и конформационных превращений в биополимерах. Его широкое применение объясняется сравнительной простотой измерений, отсутствием необходимости специального препарирования образцов в отличие от других методов (рентгеноструктурный анализ, исследование инфракрасных спектров, рассеяние света и др.). Кроме того, большое преимущество этого метода состоит в том, что при помощи современных спектрополяриметров можно исследовать очень небольшие количества вещества (малые концентрации), что особенно важно при исследовании биополимеров.

Люминесценция.

Чрезвычайно важное и плодотворное уточнение понятия о люминесценции было дано С. И. Вавиловым, который показал, что наиболее характерная особенность явлений люминесценции ­ это конечная длительность излучения, существенно превышающая период световых колебаний. По предельно сжатому и точному определению Вавилова, «люминесценцией тела в данной спектральной области называют избыток излучения над температурным при условии, что это избыточное излучение обладает конечной длительностью, превышающей период световых колебаний».

Разли­чают фотолюминесценцию – свечение, возбуждаемое ультрафиолетовым или видимым излучением, хемилюминесценцию – свечение, сопровождающее ряд химических реакций (частным случаем является биолюминесценция ­ свечение организмов, связанное с их жизнедеятельностью), рентгено- и радиолюминесценцию – свечение, вызываемое действием рентгеновских лучей или других ионизирующих излучений, катодолюминесценцию, вызываемую ударами быстрых электронов (телевизионные экраны) и т. п.

4.Гидродмнамические методы.

Вискозиметрия позволяет определить важнейшую характеристику полимера его характеристическую вязкость, связанную с размерами, формой и жесткостью молекул. Этот параметр, в частности, широко используется для определения молекулярного веса нуклеиновых кислот. Вискозиметрический метод определения молекулярных весов, однако, не является независимым, требуя градуировки при помощи абсолютных методов (светорассеяние, электронная микроскопия, авторадиография и др.).

Одним из самых распространенных и плодотворных методов изучения природных и синтетических полимеров является метод ультрацентрифугирования. Он заключается в создании больших центробежных ускорений, превышающих ускорение земного притяжения в 104 – 105 раз в роторах, вращающихся со скоростями до 60 000 об/мин. Под действием таких сильных центробежных полей происходит осаждение (седиментация) молекул растворенного полимера, аналогично осаждению крупных частиц суспензии под действием поля тяготения Земли. При низких ускорениях осаждение частиц молекулярных размеров невозможно вследствие хаотического теплового движения, влияние которого тем больше, чем меньше размер частиц.

^ Метод двойного лучепреломления (ДЛП) в потоке сочетает в себе оптический и гидродинамический подход к изучению строения макромолекул. В комбинации с другими методами, прежде всего с вискозиметрией, метод ДЛП в потоке широко характеризует исследуемые молекулы, позволяя определить разность главных поляризуемостей молекул, коэффициент вращательной диффузии, жесткость молекулы и другие параметры.

5.Электронный парамагнитный и ядерномагнитный резонанс.

Магнитный диполь, помещенный в магнитное поле, направленное вдоль оси z, начинает прец­ессировать вокруг оси z с определенной частотой ω0. При этом в плоскости (х, у) перпендикулярной направлению магнитного поля, происходит равномерное вращение проекции магнитного, момента диполя на эту плоскость с угловой скоростью ω0. Следовательно, проекция магнитного момента диполя на произвольную ось, расположенную в плоскости (х, у), совершает колебания с круговой частотой ω0. Если на систему действует, кроме того, переменное магнитное поле, направленное вдоль оси, расположенной в плоскости, то при частоте поля, равной ω0, наблюдается резонанс между колебаниями поля и дипольного момента. В случае если диполем служит электрон, явление называется электронным парамагнитным резонансом (ЭПР); если диполем служит атомное ядро, то говорят о ядерном магнитном резонансе (ЯМР).
^ Вопрос № 2. Транскрипция у эукариот. Кэпирование, полиаденилирование, спалйсинг.

Транскри́пция — процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы, происходящий во всех живых клетках. Другими словами, это перенос генетической информации с ДНК на РНК.

Транскрипция катализируется ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Процесс синтеза РНК протекает в направлении от 5'- к 3'- концу, то есть по матричной цепи ДНК РНК-полимераза движется в направлении 3'>5'.

Транскрипция состоит из стадий инициации, элонгации и терминации.

^ Инициация транскрипции — сложный процесс, зависящий от последовательности ДНК вблизи транскрибируемой последовательности. У эукариот, также и от более далеких участков генома — энхансеров (усилители) и сайленсоров (глушители) и от наличия или отсутствия различных белковых факторов.

^ Элонгация транскрипции.

Момент перехода РНК-полимеразы от инициации транскрипции к элонгации точно не определен. Три основных биохимических события характеризуют этот переход в случае РНК-полимеразы кишечной палочки: отделение сигма-фактора, первая транслокация молекулы фермента вдоль матрицы и сильная стабилизация транскрипционного комплекса, который кроме РНК-полимеразы включает растущую цепь РНК и транскрибируемую ДНК. Эти же явления характерны и для РНК-полимераз эукариот. Переход от инициации к элонгации сопровождается разрывом связей между ферментом, промотором, факторами инициации транскрипции, а в ряде случаев — переходом РНК-полимеразы в состояние компетентности в отношении элонгации. Фаза элонгации заканчивается после освобождения растущего транскрипта и диссоциации фермента от матрицы (терминация).

На стадии элонгации в ДНК расплетено примерно 18 пар нуклеотидов. Примерно 12 нуклеотидов матричной нити ДНК образует гибридную спираль с растущим концом цепи РНК. По мере движения РНК-полимеразы по матрице впереди нее происходит расплетание, а позади — восстановление двойной спирали ДНК. Одновременно освобождается очередное звено растущей цепи РНК из комплекса с матрицей и РНК-полимеразой. Элонгация осуществляется с помощью основных элонгирующих факторов, необходимых, чтобы процесс не останавливался преждевременно.

Терминация.

У эукариот обнаружены три фактора терминации транскрипции, необходимых для освобождения РНК-полимераз из транскрипционных комплексов на терминаторах.

Терминация транскрипции у эукариот - это пока довольно плохо изученный процесс. Ясно, однако, что он происходит за пределами собственно гена в области спейсера. Эксперименты с разными искусственными конструкциями показывают, что для терминации транскрипции нужно существование в геноме зоны терминации и обязательно расположенного перед нею сайта полиаденилирования. Если последний убрать, то транскрипция идет за зону терминации. В то же время зону терминации можно удалять и приближать к сайту полиаденилирования, и терминация все равно будет происходить в ее пределах.

Кэпирование.


Кэп (от англ. cap — шапочка) — модифицированный гуанозиновый нуклеотид, который добавляется на 5' (передний) конец незрелой матричной рибонуклеиновой кислоты.

5'-конец молекулы РНК (который синтезируется первым в процессе транскрипции) прежде всего кэпируется, т.е. достраивается с образованием особой структуры, ответственной за последующее связывание молекулы мРНК с рибосомой.

Эта структура состоит из остатка 7-метилгуаназина, ковалентно связанного с 5'-концевым трифосфатом. Кэпирование происходит еще до того, как синтез всей молекулы будет завершен.

Тем временем строящаяся молекула РНК продолжает расти в длину в направлении от 5'к 3'концу со скоростью 30 нуклеотидов в секунду, пока РНК-полимераза не достигнет сигнала терминации, закодированного в последовательности нуклеотидов ДНК.

Здесь транскрипция останавливается и происходит полиаденилирование.

Функции кэпа и связанных с ним белков:

  • экспорт мРНК из ядра;

  • защита 5'-конца транскрипта от экзонуклеаз;

  • участие в инициации трансляции;

  • участие в полиаденилировании.

Полиаденилирование.

Полиаденилирование происходит либо непосредственно после терминации транскрипции, либо после специфического расщепления растущей цепи РНК.

Специальный фермент - полиА-полимераза присоединяет к 3'-концу каждого РНК-транскрипта, которому суждено стать молекулой мРНК, от 100 до 200 остатков адениловой кислоты, что завершает процесс образования первичного РНК-транскрипта.

Конкретные функции полиА неизвестны, но считается, что такой "хвост" способствует последующему процессингу РНК и экспорту зрелых молекул мРНК из ядра.

Одним из обязательных этапов созревания предшественников эукариотических мРНК, синтезированных в ядре, является процессинг их 3'-концевых последовательностей, тесно сопряженный с присоединением кэп-группы.

Процесс полиаденилирования начинается сразу за расщеплением РНК и происходит настолько быстро, что неполиаденилированных промежуточных продуктов не обнаруживается. Такое сопряжение двух реакций необходимо для защиты 3'-концевых последовательностей РНК от деградации нуклеазами.

Сплайсинг.

Сплайсинг (от англ. splice — сращивать или склеивать концы чего-либо) — процесс вырезания определенных нуклеотидных последовательностей из молекул РНК и соединения последовательностей, сохраняющихся в «зрелой» молекуле, в ходе процессинга РНК. Наиболее часто этот процесс встречается при созревании информационной РНК (мРНК) у эукариот, при этом путём биохимических реакций с участием РНК и белков из мРНК удаляются участки, не кодирующие белок (интроны) и соединяются друг с другом кодирующие аминокислотную последовательность участки — экзоны. Таким образом незрелая пре-мРНК превращается в зрелую мРНК, с которой считываются (транслируются) белки клетки. Сплайсинг катализируется крупным нуклеопротеидным комплексом — сплайсосомой, состоящей из белков и малых ядерных РНК.

Список литературы

  1. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Под редакцией профессора Ю. С. Лазуркина. Издательство «Наука», М.: - 1967г., 341 с.

  2. Коничев А. С. Молекулярная биология: Учеб. для студ. пед. вузов / А. С. Коничев, Г. А. Севастьянова. – 2-е изд., испр. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 400 с.



Скачать файл (86 kb.)

Поиск по сайту:  

© gendocs.ru
При копировании укажите ссылку.
обратиться к администрации